2 Các phƣơng pháp tách chiết và cô lập hợp chất thiên nhiên
2.1.2 Phƣơng pháp chƣng cất lôi cuốn hơi nƣớc
Phƣơng pháp này dựa trên sự thẩm thấu, hòa tan, khuếch tán và lôi cuốn theo hơi nƣớc của những hợp chất hữu cơ trong tinh dầu chứa trong các mô khi tiếp xúc với hơi nƣớc ở nhiệt độ cao. Sự khuếch tán sẽ dễ dàng khi tế bào chứa dầu trƣơng phồng do nguyên liệu tiếp xúc với hơi nƣớc bão hòa trong một thơi gian nhất định.
Nguyên liệu có thể để nguyên hay cắt nhỏ vừa phải cho vào bình. Sau đó cho nƣớc vào phủ kín nguyên liệu nhƣng phải trừ một khoảng không gian phía trên để tránh nƣớc sôi mạnh làm tràn nguyên liệu qua hệ thống hoàn lƣu.
Khi nguyên liệu đƣợc làm vỡ vụn thì chỉ có một số mô chứa tinh dầu bị vỡ và cho tinh dầu thoát tƣ do ra ngoài theo hơi nƣớc cuốn đi. Phần lớn tinh dầu còn lại trong các mô thực vật sẽ tiến dần ra ngoài bề mặt nguyên liệu bằng sự hòa tan và thẩm thấu. Von Rechenberg đã mô tả quá trình chƣng cất hơi nƣớc nhƣ sau: “Ở nhiệt độ nƣớc sôi, một phần tinh dầu hòa tan vào trong nƣớc có sẵn trong tế bào thực vật. Dung dịch này sẽ thẩm thấu dần ra bề mặt nguyên liệu và bị hơi nƣớc cuốn đi. Còn nƣớc đi vào nguyên
liệu theo chiều ngƣợc lại và tinh dầu lại tiếp tục hòa tan vào lƣợng nƣớc này. Quy trình này lặp đi lặp lại cho đến khi tinh dầu trong các mô thoát ra ngoài hết”.
Ưu điểm
- Quy trình kỹ thuật tƣơng đối đơn giản. - Thiết bị gọn, dễ chế tạo.
- Không đòi hỏi vật liệu phụ nhƣ các phƣơng pháp tẩm trích, hấp phụ. - Thời gian tƣơng đối nhanh.
Nhược điểm
- Không có lợi đối với những nguyên liệu có hàm lƣợng tinh dầu thấp.
- Chất lƣợng tinh dầu có thể ảnh hƣởng nếu trong tinh dầu có những cấu phần dễ bị phân hủy.
- Không lấy đƣợc các loại nhựa và sáp trong nguyên liệu.
- Trong nƣớc chƣng luôn luôn có một lƣợng tinh dầu tƣơng đối lớn. - Những tinh dầu có độ sôi cao thƣờng cho hiệu suất rất thấp.
2.1.3 Phƣơng pháp chƣng cất lôi cuốn hơi nƣớc với sự hỗ trợ của vi sóng
Vi sóng là sóng điện từ lan truyền với vận tốc ánh sáng.
Hiện tượng làm nóng
Một số phân tử, thí dụ nhƣ nƣớc phân chia điện tích trong phân tử một cách bất đối xứng. Nhƣ vậy, các phân tử này là những lƣỡng cực có tính định hƣớng trong chiều của điện trƣờng. Dƣới tác động của điện trƣờng một chiều, các phân tử lƣỡng cực có khuynh hƣớng sắp xếp theo chiều điện trƣờng này. Nếu điện trƣờng là một điện trƣờng xoay chiều, sự định hƣớng của các lƣỡng cực sẽ thay đổi theo chiều xoay đó. Cơ sở của hiện tƣợng phát nhiệt có vi sóng là sự tƣơng tác giữa điện trƣờng và các phân tử phân cực bên trong vật chất. Trong điện trƣờng xoay chiều có tần số rất cao (2.45x109
Hz), điện trƣờng này sẽ gây ra một sự xáo động ma sát rất lớn giữa các phân tử, đó chính là hiện tƣợng nóng lên của phân tử.
Với một cơ cấu có sự bất đối xứng cao, phân tử nƣớc có độ phân cực rất lớn, do đó
phân cực nhƣ: -OH, -COOH, -NH2... trong các hợp chất hữu cơ cũng là những nhóm chịu sự tác động của trƣờng điện từ.
Do đó, những hợp chất càng phân cực càng rất mau nóng dƣới sự chiếu xạ của vi sóng. Việc này có liên quan đến hằng số điện môi của hợp chất đó. Tóm lại, sự đun nóng bởi vi sóng rất chọn lọc, trực tiếp và nhanh chóng.
Tính chất
Vi sóng có đặc tính là có thể đi xuyên qua đƣợc không khí, gốm sứ, thủy tinh, polymer và phản xạ trên bề mặt kim loại. Độ xuyên thấu tỉ lệ nghịch với tần số, khi tần số tăng lên thì độ xuyên thấu giảm. Đối với một vật chất có độ ẩm 50% với tần số 2450 MHz có độ xuyên thấu là 10cm.
Ngoài ra, vi sóng có thể lan truyền trong chân không, trong điều kiện áp suất cao… Năng lƣợng của vi sóng rất yếu, không quá 10-6 eV, trong khi năng lƣợng của một số nối đôi cộng hóa trị là 5 eV, do đó bức xạ vi sóng không phải là một bức xạ ion hóa. Có một số công trình đã khẳng định đƣợc tính vô hại của vi sóng đối với sinh vật. Chẳng hạn, khi nghiên cứu sự phát triển của enzyme trong điều kiện vi sóng, ngƣời ta nhận thấy rằng ảnh hƣởng của vi sóng rất giống với ảnh hƣởng của các gia nhiệt thông thƣờng.
Vi sóng cung cấp một kiểu đun nóng mới không dùng sự truyền nhiệt thông thƣờng. Với kiểu đun nóng bình thƣờng, sức nóng đi từ bề mặt của vật chất lần vào bên trong, còn trƣờng hợp sử dụng vi sóng, vi sóng xuyên thấu vật chất và làm nóng vật chất ngay từ bên trong. Vi sóng tăng hoạt chọn lọc những phân tử phân cực, đặc biệt là nƣớc. Nƣớc bị đun nóng do hấp thu vi sóng bốc hơi tạo ra áp suất rất cao tại nơi bị tác dụng, đẩy nƣớc đi từ tâm của vật đun ra đến bề mặt của nó.
Chiếu xạ vi sóng
Dƣới tác dụng của vi sóng, nƣớc trong các tế bào thực vật bị nóng lên thật nhanh, áp suất bên trong tăng lên đột ngột làm các mô chứa tinh dầu bị vỡ ra. Tinh dầu thoát ra bên ngoài, bị lôi cuốn theo hơi nƣớc sang hệ thống ngƣng tụ.
Ưu điểm
- Hiệu suất có thể bằng hoặc cao hơn những phƣơng pháp khác nhƣng thời gian cần thiết rất ngắn.
- Tinh dầu thu đƣợc có mùi tự nhiên.
- Sản phẩm phân hủy trong tinh dầu thƣờng giảm đi.
- Tiết kiệm thời gian, năng lƣợng dẫn đến giảm giá thành sản xuất.
Nhược điểm
- Chỉ áp dụng đƣợc cho các nguyên liệu có tuyến tinh dầu nằm ngay bên trên bề mặt lá.
- Năng lƣợng chiếu xạ lớn sẽ làm cho một số cấu phần trong tinh dầu bị phân hủy.
2.1.4 Phƣơng pháp trích siêu âm
Siêu âm là âm thanh có tần số nằm ngoài ngƣỡng nghe của con ngƣời (16 Hz–18 kHz). Siêu âm cung cấp năng lƣợng thông qua hiện tƣợng tạo và vỡ “bọt” (khoảng cách liên phân tử). Trong môi trƣờng chất lỏng, bọt có thể hình thành trong nửa chu kỳ đầu và vỡ trong nữa chu kỳ sau, giải phóng một năng lƣợng rất lớn. Năng lƣợng này có thể sử dụng tẩy rửa chất bẩn ngay trong những vị trí không thể tẩy rửa bằng phƣơng pháp thông thƣờng, khoan cắt những chi tiết tinh vi, hoạt hóa nhiều loại phản ứng hóa học, làm chảy và hòa tan lẫn vào nhau trong việc chế tạo những sản phẩm bằng nhựa nhiệt dẻo,…
Trong lĩnh vực hợp chất thiên nhiên, siêu âm chủ yếu sử dụng để hỗ trợ cho phƣơng pháp tẩm trích giúp thu ngắn thời gian ly trích. Trong một số trƣờng hợp, phƣơng pháp siêu âm cho hiệu suất cao hơn phƣơng pháp khuấy từ.
Trong trƣờng hợp tinh dầu vì sự ly trích bằng siêu âm đƣợc thực hiện ở nhiệt độ phòng nên sản phẩm luôn có mùi thơm tự nhiên.
2.1.5 Phƣơng pháp trích bằng CO2 lỏng siêu tới hạn
Hiện nay CO2 lỏng siêu tới hạn (SFE – Supercritical Fluid Extraction) đƣợc sử dụng nhƣ một dung môi để trích ly tinh dầu. Phƣơng pháp này có lợi điểm là tinh dầu thu đƣợc có chất lƣợng cao, cô lập sản phẩm rất dễ dàng vì CO2 ở áp suất thƣờng sẽ bốc
Do tính chất đặc biệt của CO2 ở trạng thái siêu tới hạn là vừa có tính chất của chất lỏng lại vừa có tính chất của chất khí, dễ dàng thẩm thấu và khuếch tán vào bên trong nguyên liệu nên hoạt chất đƣợc tách triệt để. Đồng thời với phƣơng pháp này nhiệt độ của CO2 lỏng siêu tới hạn không cao nên hạn chế hƣ chất, biến chất.
Phƣơng pháp này chƣa phổ biến trong kỹ nghệ vì giá thành thiết bị còn cao và lƣợng nguyên liệu còn hạn chế, điều kiện tối ƣu để ly trích đang đƣợc nghiên cứu.
2.1.6 Phƣơng pháp chiết rắn – lỏng
a. Kỹ thuật chiết ngâm dầm
Kỹ thuật này không đòi hỏi thiết bị phức tạp, vì vậy dễ dàng thao tác với một lƣợng mẫu lớn. Mẫu đƣợc chứa trong bình bằng thủy tinh hoặc bằng thép không gỉ có nắp đậy. Tránh sử dụng bình nhựa vì dung môi hữu cơ có thể hòa tan một ít nhựa, gây nhầm lẫn là hợp chất đó chứa trong mẫu. Rót dung môi vào bình cho đến khi xấp xấp bề mặt mẫu. Giữ yên ở nhiệt độ phòng trong một đêm hoặc một ngày để cho dung môi thấm vào mẫu. Sau đó, dịch chiết đƣợc lọc qua giấy lọc, cô quay dịch thu đƣợc thu hồi dung môi đƣợc dịch cao chiết.
b. Kỹ thuật chiết bằng thiết bị Soxhlet
Hình 3.1 Bộ chiết soxhlet
Dụng cụ gồm 3 bộ phận tháo ráp đƣợc tại các nút mài. Gồm bình cầu chứa dung môi, ống đựng mẫu và ống sinh hàn.
Ống sinh hàn
Bình cầu chứa dung môi
Ống đựng
mẫu Ống thông nhau
Ống dẫn hơi dung môi
Mẫu đƣợc làm khô đƣợc đặt trong túi vải và đặt trong ống đựng mẫu. Không đƣợc để lƣợng mẫu cao hơn mức cong của ống dẫn hơi dung môi.
Rót dung môi đã lựa chọn vào bình cầu, điều chỉnh nhiệt độ sao cho dung môi trong bình cầu sôi nhẹ đều. Dung môi tinh khiết khi đun nóng sẽ bay hơi đi theo ống dẫn hơi dung môi và đƣợc ngƣng tụ. Sau đó thấm ƣớt vào mẫu và chiết những chất hữu cơ nào có thể hòa tan vào dung môi. Theo quá trình đun nóng, lƣợng dung môi ngƣng tụ càng nhiều, mức dung môi dâng lên cao rồi đi xuống bình cầu theo ống thông nhau. Lƣu ý là dung môi không đƣợc nhiều hơn 2/3 thể tích bình cầu.
Ưu điểm: kỹ thuật chiết soxhlet tiết kiệm dung môi, chỉ một lƣợng ít dung môi mà chiết kiệt đƣợc lƣợng mẫu, không qua quá trình lọc và thêm dung môi.
Khuyết điểm:
- Vì kích thƣớc của dụng cụ hạn chế nên cũng hạn chế khối lƣợng mẫu cần chiết. - Quá trình chiết tách đƣợc đun nóng liên tục nên có thể phá hủy các chất kém bền với nhiệt.
- Giá thành thiết bị khá cao.
2.2 Phƣơng pháp cô lập hợp chất thiên nhiên 2.2.1 Sắc ký cột 2.2.1 Sắc ký cột
Sắc ký cột đƣợc tiến hành ở điều kiện áp suất khí quyển. Pha tĩnh thƣờng là những hạt có khích thƣớc từ 50 – 150m, đƣợc nạp vào trong một cột thủy tinh. Mẫu chất cần phân tách đƣợc đặt ở phần trên đầu cột. Dung môi giải ly đƣợc hứng phía dƣới cột. Sắc ký cột làm cho sự tách chậm, hiệu quả thấp so với sắc ký lỏng cao áp (HPLC). Tuy vậy, sắc ký cột có thể triển khai với một lƣợng mẫu lớn.
Trong sắc ký cột với pha tĩnh là silica gel loại thƣờng, hợp chất không phân cực đƣợc giải ly ra khỏi cột trƣớc hợp chất phân cực.
Với hai phân tử không phân cực, phân tử có trọng lƣợng phân tử lớn sẽ có tính phân cực mạnh hơn phân tử kia, nó bị pha tĩnh giữ lại trong cột nên di chuyển ra khỏi cột chậm hơn phân tử nhỏ.
Trƣớc khi khai triển sắc ký cột, phải sắc ký bảng mỏng trƣớc để dò tìm hệ dung môi
Tỷ lệ giữa lƣợng mẫu cần tách và lƣợng chất hấp thu sử dụng
Để tách đƣợc các chất tốt ra khỏi hỗn hợp thì mối quan hệ giữa lƣợng mẫu chất cần tách đối với kích thƣớc cột phải thật thích hợp. Đối với sắc ký cột hở, cột nhỏ nhất có thể tích chỉ vài mL, với đƣờng kính cột vài mm. Qua các khảo nghiệm cho thấy muốn tách chất tốt thì trọng lƣợng chất hấp thu phải lớn hơn 25 – 50 lần trọng lƣợng của mẫu chất cần sắc ký. Đối với các chất khó tách thì cần sử dụng lƣợng chất hấp thu nhiều hơn (100 – 200 lần) và ngƣợc lại.
Các khảo nghiệm cũng cho thấy tỉ lệ giữa chiều cao chất hấp thu và đƣờng kính trong của cột cũng ảnh hƣởng đến quá trình chiết tách. Chiều cao của chất hấp thu nạp trong cột và đƣờng kính trong của cột cần đạt tỉ lệ khoảng 10:1.
Nạp chất hấp thu vào cột
Muốn tách riêng các hợp chất hấp thu trong hỗn hợp một cách có hiệu quả, chất hấp thu phải đƣợc nạp một cách đồng nhất để hạn chế những dãy xéo, bất thƣờng.
Kích thƣớc hạt cũng giữ một vai trò quan trọng, nếu hạt có kích thƣớc quá mịn thì cột sẽ quá chặt làm dung môi không thể chảy ra khỏi cột đƣợc, để có thể có một vận tốc chảy chấp nhận đƣợc thì khích thƣớc hạt chất hấp thu thƣờng > 150m.
Có hai kiểu nạp chất hấp thu vào cột: nạp cột khô và nạp cột ƣớt.
Nạp cột khô
Dùng kẹp để giữ cột thẳng đứng trên giá, cho dung môi loại kém phân cực nhất có thể vào khoảng 2/3 chiều cao cột. Để phễu lọc có đuôi dài trên đầu cột rồi cho chất hấp thu ở dạng bột khô vào thẳng trong cột, đều đặn, mỗi lần một lƣợng nhỏ, vừa cho vừa gõ nhẹ vào thành cột. Khi lớp hấp thu đạt đƣợc chiều cao khoảng 2cm thì mở nhẹ khóa cho dung môi chảy ra, hứng vào một becher trống để bên dƣới cột, dung môi này đƣợc sử dụng lại để rót trả lại lên đầu cột.
Sau khi nạp hết lƣợng chất hấp thu, cho dung môi chảy qua chất hấp thu vài lần đến khi thấy chất hấp thu trong cột có dạng đồng nhất.
Với phƣơng pháp này thì tránh hiện tƣợng khô cột.
Nạp mẫu vào cột
Nếu mẫu ở dạng lỏng, có thể cho trực tiếp mẫu lên đầu cột sắc ký. Các bƣớc nạp mẫu:
- Mở khóa cho dung môi chảy ra khỏi cột, để hạ mức dung môi trong cột xuống sao cho vừa sát với mặt thoáng của chất hấp thu trong cột. Mặt thoáng của chất hấp thu lúc này phải nằm ngang.
- Đóng khóa lại, dùng pipette hút dịch mẫu, đặt đầu pipette gần sát với mặt thoáng của chất hấp thu trong cột và sát thành cột. Sau đó, cho từ từ mẫu xuống.
- Mở khóa cho dung môi chảy ra khỏi cột để dịch mẫu thấm đều vào chất hấp thu và không cho cột bị khô.
- Cho tiếp tục dung môi giải ly vào cột và bắt đầu quá trình giải ly.
Dung môi giải ly
Trong sắc ký cột, có khi chỉ cần sử dụng một đơn dung môi là có thể giải ly tất cả các chất ra khỏi cột, đôi khi cần đến hỗn hợp dung môi. Thƣờng thì sử dụng dung môi không phân cực để giải ly các hợp chất không phân cực trƣớc. Tiếp theo sử dụng dung môi phân cực hơn để giải ly các hợp chất có tính phân cực hơn.
Bảng 3.1 Các dung môi thƣờng dùng trong sắc ký cột
Dung môi Nhiệt độ sôi (oC) Hằng số điện môi (ở 25oC) Chỉ số phân cực Độ nhớt (mN.S.m-2) Độ tan trong nƣớc (% w/w) Pentane Hexane Heptane Cyclohexane Tetraclorur Carbon Toluene Xylene Benzene Dietyl Eter Diclorometane Dicloroetane Isopropanol N-Butanol Tetrahydrofurane 36 69 98 81 77 111 139 80 35 41 84 82 118 65 1.8 1.9 - 2.0 2.2 2.38 - 2.3 4.34 8.9 - 18.3 - 7.58 0.0 0.0 0.0 0.2 1.6 2.4 2.5 2.7 2.8 3.1 3.5 3.9 3.9 4.0 0.23 0.33 0.39 1.00 0.97 0.59 0.61 0.65 0.32 0.44 0.79 2.30 2.98 0.55 0.0040 0.0010 0.0003 0.1000 0.0800 0.5100 0.0180 6.8900 1.6000 0.8100 100.00 7.8100 100.00 100.00