2 Các bƣớc thực hiện
2.2Chƣng cất tinh dầu và cao chiết
Quy trình thực hiện:
Hình 5.1 Quy trình thực hiện
2.2.1 Chƣng cất tinh dầu bằng phƣơng pháp chƣng cất lôi cuốn hơi nƣớc cổ điển
a) Khảo sát lượng tinh dầu theo thời gian chưng cất
Gừng: cho 500g nguyên liệu đã xay nhuyễn vào bình cầu 1000ml, thêm 500ml nƣớc cất, tiến hành chƣng cất trong khoảng thời gian 1.5 giờ, 2 giờ, 2.5 giờ, 3 giờ, 3.5 giờ, 4 giờ, 4.5 giờ, 5 giờ và 6 giờ.
Khảo sát hoạt tính sinh học
- Trích bằng EtOH - - Loại dung môi
Chưng cất
Nguyên liệu
Tinh dầu tiêu Bã gừng
Bã Cao G Sắc ký cột Khảo sát chỉ số hóa lý Phối chế lotion tan mỡ Sản phẩm tan mỡ dạng lotion Chất tinh khiết Kết tinh Khảo sát 7
thông số tối ưu
Tinh dầu gừng Bã tiêu
Khảo sát thành phần hóa học
Tiêu: cho 300g nguyên liệu đã đƣợc xay nhuyễn vào bình cầu 1000ml, thêm 600ml nƣớc cất, tiến hành chƣng cất trong khoảng thời gian 1.5 giờ, 2 giờ, 2.5 giờ, 3 giờ, 3.5 giờ, 4 giờ, 4.5 giờ, 5 giờ và 6 giờ.
Chọn thời gian thích hợp sao cho lƣợng tinh dầu thu đƣợc nhiều nhất.
b) Khảo sát lượng tinh dầu theo nhiệt độ làm lạnh
Gừng: cho 500g nguyên liệu đã xay nhuyễn vào bình cầu 1000ml, thêm 500ml nƣớc cất, tiến hành chƣng cất trong khoảng thời gian ở thí nghiệm (a), khảo sát nhiệt độ làm lạnh ở 20oC, 14oC, 4oC.
Tiêu: cho 300g nguyên liệu đã đƣợc xay nhuyễn vào bình cầu 1000ml, thêm 600ml nƣớc cất, tiến hành chƣng cất trong khoảng thời gian ở thí nghiệm (a), khảo sát nhiệt độ làm lạnh ở 20oC, 14oC, 4oC.
Chọn nhiệt độ làm lạnh sao cho lƣợng tinh dầu thu đƣợc nhiều nhất.
2.2.2 Phƣơng pháp chƣng cất hơi nƣớc có sự hỗ trợ của vi sóng
a) Khảo sát tinh dầu theo nhiệt độ làm lạnh
Gừng: Cho 500g nguyên liệu đã xay nhuyễn vào bình cầu 2000ml, thêm 500ml nƣớc cất, tiến hành chƣng cất trong 20 phút, công suất 450W, khảo sát nhiệt độ làm lạnh ở 20oC, 14oC, 4oC.
Tiêu: Cho 300g nguyên liệu đã xay nhuyễn vào bình cầu 2000ml, thêm 300ml nƣớc cất, tiến hành chƣng cất trong 20 phút, công suất 450W, khảo sát nhiệt độ làm lạnh ở 20oC, 14oC, 4oC.
Chọn nhiệt độ làm lạnh sao cho lƣợng tinh dầu thu đƣợc nhiều nhất
b) Khảo sát tinh dầu theo công suất chiếu xạ
Gừng: Cho 500g nguyên liệu đã xay nhuyễn vào bình cầu 2000ml, thêm 500ml nƣớc cất, tiến hành chƣng cất trong 20 phút, nhiệt độ làm lạnh đƣợc chọn ở thí nghiệm (a), công suất khảo sát là 80W, 150W, 300W, 450W, 750W và 900W.
Tiêu: Cho 300g nguyên liệu đã xay nhuyễn vào bình cầu 2000ml, thêm 300ml nƣớc cất, tiến hành chƣng cất trong 20 phút, nhiệt độ làm lạnh đƣợc chọn ở thí nghiệm (a), công suất khảo sát là 80W, 150W, 300W, 450W, 750W và 900W.
Chọn công suất thích hợp sao cho lƣợng tinh dầu thu đƣợc nhiều nhất.
c) Khảo sát tinh dầu theo thời gian chưng cất
Gừng: Cho 500g nguyên liệu đã xay nhuyễn vào bình cầu 2000ml, thêm 500ml nƣớc cất, tiến hành chƣng cất trong khoảng thời gian 20 phút, 25 phút, 30 phút, 35 phút, 40 phút và 45 phút với công suất đƣợc chọn ở thí nghiệm (b), nhiệt độ làm lạnh ở thí nghiệm (a). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tiêu: Cho 300g nguyên liệu đã xay nhuyễn vào bình cầu 2000ml, thêm 300ml nƣớc cất, tiến hành chƣng cất trong khoảng thời gian 20 phút, 25 phút, 30 phút, 35 phút, 40
phút và 45 phút với công suất đƣợc chọn ở thí nghiệm (b), nhiệt độ làm lạnh ở thí nghiệm (a).
Chọn thời gian chƣng cất thích hợp sao cho lƣợng tinh dầu thu đƣợc nhiều nhất.
d) Khảo sát tinh dầu trong trường hợp không dùng nước
Hai mẫu nguyên liệu đƣợc tiến hành với các thông số đƣợc chọn ở các thí nghiệm (a), (b) và (c), không cần thêm nƣớc. So sánh lƣợng tinh dầu thu đƣợc với trƣờng hợp có dùng nƣớc.
2.3 Khảo sát các chỉ số hóa lý của tinh dầu Tiêu và tinh dầu Gừng 2.3.1 Cảm quan 2.3.1 Cảm quan
Dùng phƣơng pháp cảm quan để nhận xét màu sắc, mùi vị của tinh dầu.
2.3.2 Tỷ trọng
Tỷ trọng của tinh dầu ở 20o
C (d20
20) là tỷ số của khối lƣợng tinh dầu ở 20oC với khối lƣợng của cùng thể tích nƣớc cất cũng ở 20o C. Chuẩn bị: - Nƣớc cất đã đƣa về nhiệt độ 20o C. - Dung dịch thử đã đƣa về 20o C.
- Picnomet đã đƣợc vệ sinh sạch và khô hoàn toàn.
Cách xác định:
- Trƣớc tiên rửa sạch bình tỷ trọng, tráng kỹ lại bằng aceton hoặc ethanol, sấy thật khô, để nguội, cân khối lƣợng của picnomet rỗng (m0).
- Đổ đầy nƣớc cất vào picnomet. Đậy nắp và lau khô phần nƣớc tràn ra từ ống dẫn cân bằng trên nắp của picnomet. Lau khô toàn bộ bên ngoài picnomet.
- Cân khối lƣợng của picnomet và nƣớc cất trên cân phân tích 4 số (m1).
- Đổ đầy mẫu thử tinh dầu vào picnomet sử dụng để cân nƣớc cất đã đƣợc vệ sinh và làm khô. Đậy nắp và lau khô phần mẫu thử tràn ra từ ống dẫn cân bằng trên nắp của picnomet. Lau khô toàn bộ bên ngoài picnomet.
- Cân khối lƣợng của picnomet và mẫu thử tinh dầu trên cân phân tích 4 số (m2). Tỉ trọng của tinh dầu đƣợc xác định theo công thức :
d20 20 = 0 1 0 2 m m m m Trong đó: m0: khối lƣợng tỷ trọng kế rỗng (g) m1: khối lƣợng tỷ trọng kế và nƣớc cất (g) m2: khối lƣợng tỷ trọng kế và tinh dầu (g)
2.3.3 Chỉ số acid (IA)
Chỉ số acid (IA, indice d’acide) là số mg KOH cần thiết để trung hòa các acid tự do có trong 1g tinh dầu.
KOH trung hòa các acid tự do trong tinh dầu theo phản ứng:
RCOOH + KOH RCOOK + H2O
Chuẩn bị:
- Chuẩn bị chất chỉ thị màu: dung dịch phenolphtalein 2 g/l trong ethanol 95%.
Cách xác định:
- Cho khoảng 2g ± 0.05g tinh dầu vào erlen 125 mL, thêm 5 mL ethanol, 1 giọt dung dịch phenolphtalein. Thực hiện việc chuẩn độ bằng cách nhỏ từ từ dung dịch KOH 0.1 N từ microburette vào erlen để trung hòa acid tự do có trong tinh dầu cho đến khi dung dịch vừa xuất hiện màu hồng.
Nếu thể tích KOH sử dụng dƣới 3ml, làm lại thí nghiệm với một lƣợng tinh dầu nhiều hơn.
- Ghi nhận khối lƣợng tinh dầu (mtd) và thể tích dung dịch KOH 0.1 N (VKOH) trong etanol để chuẩn độ. Chỉ số acid đƣợc tính theo công thức:
KOH td (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
V m IA 5.61 mtd: khối lƣợng tinh dầu (g)
VKOH: thể tích dung dịch KOH (ml)
2.3.4 Chỉ số savon hóa (IS)
Chỉ số savon hóa (IS, indice de saponification) là số mg KOH cần thiết để tác dụng với tất cả các acid tự do và acid kết hợp dƣới dạng ester có trong 1g tinh dầu.
Quá trình savon hóa tinh dầu bao gồm:
KOH trung hòa các acid tự do: KOH + RCOOH RCOOK + H2O và KOH xà phòng hóa các ester: KOH + R1COOR2 R1COOK + R2OH
- Cho khoảng 2 ± 0.05g tinh dầu vào bình cầu cổ nhám 100 mL, thêm 20 mL KOH 0.1 N trong etanol, đun hoàn lƣu trong 2 giờ để savon hóa ester và trung hòa acid tự do có trong mẫu. Để nguội, thêm vài giọt phenolphthaleine.
- Thực hiện việc chuẩn độ bằng cách cho từ từ từng giọt dung dịch HCl 0.1 N từ microburette vào bình cầu để trung hòa lƣợng KOH còn dƣ đến khi dung dịch mất màu hồng. Thực hiện phép đo 3 lần. Ghi nhận khối lƣợng tinh dầu mtd và thể tích V1 dung dịch HCl 0.1 N dùng để chuẩn độ. Thực hiện tƣơng tự với mẫu trắng là 2 ± 0.05g nƣớc cất, ghi nhận thể tích V0 dung dịch HCl 0.1N dùng để chuẩn độ.
- Chỉ số savon hóa đƣợc tính theo công thức: 0 1 28.05 td IS V V m
Trong đó: V0: thể tích dung dịch HCl 0.1N dùng để chuẩn mẫu trắng. V1: thể tích dung dịch HCl 0.1 N dùng để chuẩn mẫu tinh dầu.
2.3.5 Chỉ số ester (IE)
Chỉ số ester (IE, indice d’ester) là số mg KOH cần thiết để trung hòa lƣợng acid phóng thích ra khi thủy giải các ester có trong 1g tinh dầu.
Cách xác định:
Chỉ số ester của tinh dầu là hiệu số giữa chỉ số savon hóa và chỉ số acid. IE = IS – IA
2.4 Khảo sát thành phần hóa học
Thành phần hóa học của tinh dầu đƣợc xác định bằng phƣơng pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS).
Cách xác định đƣợc tiến hành tại Công ty TNHH MTV Khoa học Công nghệ Hoàn Vũ – Trung tâm Phân tích Công nghệ cao Hoàn Vũ, số 112A Lƣơng Thế Vinh – Phƣờng Tân Thới Hòa – Quận Tân Phú – TP. Hồ Chí Minh.
Sắc ký cột đƣợc thực hiện trên cột sắc ký 3 x 40 cm, pha tĩnh silica gel Merck, Germany
Bản mỏng đƣợc dùng là bản nhôm silica gel 60F254 tráng sẵn, kích thƣớc 20 x 20 cm, độ dày lớp hấp phụ 2,2 mm của hãng Merck, Germany.
2.5 Khảo sát hoạt tính sinh học của tinh dầu gừng và tiêu 2.5.1 Hoạt tính kháng oxy hóa 2.5.1 Hoạt tính kháng oxy hóa
Hoạt tính kháng oxy hóa đƣợc thực hiện bằng phƣơng pháp DPPH, tại phòng thí nghiệm Hóa Hữu cơ - Khoa Công Nghệ - Trƣờng đại học Cần Thơ.
DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) là gốc tự do bền, màu tím. Khi gặp các chất có khả năng cho H, chuyển về dạng khử có màu vàng nhạt. Đo độ hấp thu của mẫu thử ở bƣớc sóng 517 nm để xác định đƣợc % ức chế. N NO2 NO2 O2N N NH NO2 NO2 O2N N + RH + R 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazine
Để khảo sát khả năng kháng oxy hóa, ngƣời ta dùng thuật ngữ: % ức chế Q và Q đƣợc tính theo công thức: 100 A A A Q 0 c 0
Trong đó: A0: độ hấp thu của DPPH khi không có mẫu (trắng mẫu). Ac: độ hấp thu của dung dịch phản ứng.
Cách xác định:
- Hòa tan tinh dầu trong DMSO ở nồng độ: 500 µg/mL. - DPPH hòa tan trong dung môi ethanol ở nồng độ 250 µM.
- Cho 8 mL dung dịch DPPH nồng độ 250 µM phản ứng với 2 mL dung dịch tinh dầu nồng độ 500 µg/mL.
- Dung dịch đƣợc lắc đều, thực hiện phản ứng ở điều kiện nhiệt độ phòng trong thời gian 30 phút, đem mẫu đo độ hấp thu ở bƣớc sóng 517 nm. Đo ở 2 lần lặp lại.
- Độ hấp thu đo trên máy Quang phổ UV – Vis. - Tính % ức chế Q theo công thức trên.
2.5.2 Hoạt tính kháng vi sinh vật [5] (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
a. Vi sinh vật thử nghiệm
1. Staphylococcus aureus ATCC 25923: là vi khuẩn Gram (+), hiếu khí hay kị khí tùy nghi, có hình cầu, tụ thành chùm, đôi khi từng đôi hay từng tế bào đơn. Loài này sản sinh một số loại độc tố đƣờng ruột bền nhiệt, chúng không bị phân hủy khi đun ở 100oC trong khoảng 30 phút, gây các triệu chứng lâm sàng nhƣ tiêu chảy, nôn mửa. Ngoài ra, Staphylococcus aureus còn có thể xâm nhập vào da và niêm mạc, gây viêm loét da hay nội quan, nhiễm trùng máu. Sự nhiễm trùng xảy ra ở những cơ thể có sức đề kháng kém nhƣ ngƣời già yếu, trẻ còn bú hay ngƣời đang mắc bệnh tiểu đƣờng.
2. Bacillus subtilis ATCC 25923: là vi khuẩn Gram (+), thông thƣờng có trong tự nhiên, đƣợc sử dụng để khảo sát hoạt lực của các chất kháng sinh. Trong thực tế, vi khuẩn này vẫn có thể gây bệnh nhƣ nhiễm khuẩn huyết, ngộ độc thực phẩm.
3. Escherichia coli ATCC 25922: là vi khuẩn Gram (-), bình thƣờng có trong phân ngƣời khỏe mạnh và có khả năng gây tiêu chảy mãn tính hay cấp tính, nhất là ở trẻ em. Ngoài ra nó còn gây ra các bệnh nhƣ: nhiễm khuẩn đƣờng tiểu, nhiễm khuẩn huyết, viêm màng não. Escherichia coli tiết ra độc tố ruột, colixin, penixilinaza…
4. Salmonella typhi ty2: là trực khuẩn Gram (-) không sinh bào tử, vi khuẩn này là nguyên nhân gây bệnh thƣơng hàn.
5. Candida albicans: là loài nấm men nội sinh thƣờng gây ra ở niêm mạc hay da bị tổn thƣơng, đôi khi gây nhiễm trùng huyết, viêm nội mạc cơ tim và viêm màng não, là tác
nhân gây bệnh Candiadiasis hay “thrush” là một loại bệnh nấm phụ khoa ở phụ nữ và bệnh nấm miệng ở trẻ.
6. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853: là vi khuẩn Gram (-), gây nhiễm khuẩn ngoài da, viêm tai ngoài, viêm xoang, viêm mắt, viêm đƣờng ruột, viêm màng não, viêm phổi.
7. Enterococcus faecalis (Streptococcus faecalis): là các liên cầu khuẩn Gram (+), có nguồn gốc từ phân có hình cầu hay hình oval kéo dài, thƣờng tụ tập thành từng đôi hay chuỗi, không sinh bào tử. Vi khuẩn này thƣờng gây bệnh nhiễm trùng tiểu, đặc biệt là nhiễm trùng tiểu tại bệnh viện. Enterococcus faecalis tiết ra superoxide gây một kích ứng mạnh với các tế bào miễn dịch gọi là đại thực bào. Với một số tế bào đƣờng ruột, nó còn làm thay đổi cả cách thức tăng trƣởng, phân chia và thậm chí là tăng hiệu năng của những gen liên quan đến bệnh ung thƣ.
8. NấmAspergillus Niger: có cấu tạo đa bào, tạo thành những tổ chức khác nhau nhƣ sợi khí sinh, sợi cơ chất. Sợi cơ chất của nấm mốc không đơn giản nhƣ ở xạ khuẩn mà phức tạp hơn. Ở loài Aspergillus niger có sợi cơ chất giống nhƣ rễ chùm ở thực vật gọi là rễ giả. Ở những loài nấm mốc ký sinh trên thực vật, sợi cơ chất tạo thành những cấu trúc đặc biệt gọi là vòi hút. Chúng là nấm mốc thƣờng gây bệnh hại cây trồng, làm thối rữa rau quả trong quá trình bảo quản. Trong kỹ thuật môi trƣờng, chúng đƣợc dùng làm tác nhân phân hủy rác hiệu quả. Khả năng gây bệnh của các chủng Aspergillus đang đƣợc nghiên cứu nhiều. Các sản phẩm sinh học từ chủng nấm này cũng đang đƣợc nghiên cứu và cho thấy phần nào có lợi trong chăn nuôi.
b. Phương pháp thử nghiệm
Phương pháp pha loãng liên tục trong môi trường thạch xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC
Thí nghiệm thực hiện tại phòng thí nghiệm Sinh kỹ thuật môi trƣờng - Khoa Môi trƣờng và Tài nguyên Thiên nhiên - Trƣờng Đại học Cần Thơ, bao gồm các chủng
Aspergillus Niger, Escherichia coli ATCC 25922.
Bacillus subtilis ATCC 6633, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Staphylococus aureus ATCC 25923, Samonella typhi Ty2 và Candida albicans ATCC 10231 do viện Pasteur thực hiện.
Chủng nấm thử nghiệm: Aspergillus Niger, môi trƣờng nuôi cấy là Potato dextrose agar (Autoclause).
Chủng vi khuẩn Gram (-) thử nghiệm: Escherichia coli ATCC 25922 (E. coli), môi trƣờng nuôi cấy là Coliform agar (No autoclause).
Các bƣớc tiến hành rà MIC với chủng vi khuẩn Gram âm thử nghiệm
Escherichia coli:
Nấu thạch: Cân 8g Coliform agar cho vào 300 mL nƣớc cất, tiến hành khuấy có gia nhiệt cho đến khi Coliform agar tan đều hết trong nƣớc cất (dung dịch không còn đục). Đổ thạch: dùng ống đong đong 25mL môi trƣờng cho vào mỗi đĩa petri, sau đó cho một lƣợng tinh dầu ở các nồng độ khảo sát vào môi trƣờng lắc nhẹ cho tinh dầu phân tán đều trong môi trƣờng, thao tác đƣợc thực hiện trong tủ cấy ở chế độ quạt để làm khô môi trƣờng.
Pha loãng mẫu: Lấy 1 mL mẫu vi sinh vật đem đi pha loãng ở nồng độ 10-4.
Cấy vi sinh vật lên đĩa vừa chuẩn bị: dùng que cấy trải đều 500 µL mẫu vi khuẩn đã pha loãng lên mặt thạch. Dùng thanh gạt (sau khi đã khử trùng) trải đều huyền dịch vi khuẩn trên bề mặt môi trƣờng. Để mẫu hấp thụ hoàn toàn vào môi trƣờng trƣớc khi mang đi ủ.
Ủ trong tủ ủ vi sinh (model BE 600) trong 2 ngày rồi quan sát kết quả: Tiến hành đếm số lƣợng tế bào vi khuẩn còn sống hiện diện trong các đĩa petri bằng phƣơng pháp đếm khuẩn lạc[2]. Trong phƣơng pháp này, cần thực hiện pha loãng mẫu thành nhiều độ pha loãng theo dãy thập phân liên tiếp sao cho có độ pha loãng với mật độ tế bào thích hợp để xuất hiện các khuẩn lạc riêng lẻ trên mặt thạch với số lƣợng đủ lớn để hạn chế sai số khi đếm và tính toán. Mật độ tế bào quá lớn làm các khuẩn lạc chồng chéo lên nhau