Các điều kiện nuôi cấy có ảnh hưởng quan trọng đến sinh trưởng cũng như trao đổi chất của VSV nói chung, đến sinh trưởng và sinh KS của NS nói riêng. Các điều kiện nuôi cấy bao gồm số lượng và chất lượng của các thành phần của MT cần thiết cho việc xây dựng tế bào và trao đổi năng lượng của VSV (nguồn nitơ, carbon, phospho, vi lượng, vitamin và chất kích thích sinh trưởng), các yếu tố vật lí và hóa học (pH, thế oxy hóa khử, nhiệt độ, độ thông khí,…). Tất cả các yếu tố này cùng với nhau và từng yếu tố riêng lẻ đóng vai trò quan trọng trong sinh trưởng của VSV và trong các chức năng sinh lí và sinh hóa của chúng [36].
MT nuôi cấy: Sự lựa chọn MT thích hợp để nuôi cấy VSV rất quan trọng trong việc làm
sáng tỏ khả năng sản xuất KS của chúng. Hầu hết các VSV có thể phát triển nhanh chóng trên MT tự nhiên vì chúng chứa tất cả các thành phần chính cần thiết cho sự sinh trưởng của VSV. Tuy nhiên, không phải tất cả các MT tự nhiên đều có thể được sử dụng để xác định các đặc điểm KS của VSV. MT bán tổng hợpđược sử dụng cho công nghiệp sản xuất CKS, acid amin, vitamin, và những sản phẩm thứ cấp khác có giá trị từ VSV [36].
MT được chọn để lên men sản xuất KS tùy thuộc vào từng loại chủng sản xuất khác nhau. Nhìn chung, một MT chất lượng tốt phải đáp ứng các yêu cầu sau: đảm bảo cho VSV phát triển và tạo nhiều KS nhất, thành phần dễ kiếm, dễ lọc, thuận tiện cho việc tách chiết và tinh sạch CKS [10].
Nguồn dinh dưỡng carbon
Nguồn dinh dưỡng carbon khác nhau có ảnh hưởng khác nhau lên sự sinh trưởng cũng như sinh KS của NS [36].
Trong quá trình nuôi cấy P. chrysogenum, nếu chỉ sử dụng glucose làm nguồn dinh dưỡng carbon, lượng penicillin tối đa được tạo thành sau 50 giờ, và sản lượng penicillin sẽ thấp hơn. Nếu chỉ sử dụng lactose sản lượng penicillin tăng lên, lượng penicillin đạt mức độ tối đa ở 150 giờ hoặc 160 giờ. Do đó, trong công nghiệp sản xuất penicillin người ta sử dụng cả đường glucose và lactose, giúp đảm bảo tốc độ sinh trưởng của NS và sản lượng penicillin cao [2], [36].
Nguồn dinh dưỡng nitơ
Nguồn dinh dưỡng nitơ có ảnh hưởng quan trọng đến sinh tổng hợp KS của NS. Người ta có thể sử dụng muối nitrat hoặc muối nitrit, muối amoni hữu cơ hoặc muối amoni với kim loại, acid amin, protein và các sản phẩm thủy phân của nó (peptone) làm nguồn dinh dưỡng nitơ. Nitơ có mặt trong MT nuôi cấy ở dạng oxy hóa (NO3, NO2-) hoặc dạng khử (NH4+, NH2+).
Trong lên men penicillin, nguồn cung cấp thức ăn nitơ có thể sử dụng bột đậu tương, bột hạt bông, các loại dầu cám. Ngoài ra, cũng có thể cung cấp liên tục (NH4)2SO4 nhưng duy trì ở nồng độ thấp, nếu dư thừa hiệu quả sinh tổng hợp penicillin sẽ giảm, nếu thiếu sẽ xảy ra hiện tượng tự phân của sợi nấm [2].
Các nguyên tố khoáng đa lượng và vi lượng
Các hợp chất chứa các nguyên tố khoáng như phospho, kali, canxi, magiê, lưu huỳnh, sắt, mangan, kẽm, đồng,… có ảnh hưởng rất lớn đến sự sống và hoạt tính sinh học của VSV.
Phospho là thành phần của những hợp chất quan trọng nhất trong tế bào: nucleoprotein, acid nucleic, polyphosphate, và phospholipid. Các hợp chất chứa phospho đóng vai trò quan trọng trong nhiều phản ứng hóa học, trong trao đổi carbon và trong chuyển hóa năng lượng. Sự khác biệt về hàm lượng phospho có ảnh hưởng quan trọng đến sinh trưởng của NS. Khoảng 30 - 50% phospho được NS sử dụng trong khoảng 24 giờ đầu tiên trong quá trình nuôi cấy [36].
Lưu huỳnh là thành phần của protein và một số enzyme và coenzyme A. Người ta thường sử dụng các muối sulphate thường làm nguồn lưu huỳnh cho MT. Lưu huỳnh là thành phần của một số CKS từ NS như penicillin, cephalosporin. Dạng lưu huỳnh thích hợp nhất cho sinh tổng hợp penicillin là natri thiosulphate. Biến đổi hàm lượng lưu huỳnh trong MT có thể làm thay đổi trạng thái sinh lí của sợi nấm P. chrysogenum và sản lượng penicillin [36].
Kali hoạt động như nhân tố kích hoạt một số enzyme (amylase, invertase), nó kích thích sự hydrate hóa trong tế bào chất. Thiếu hụt kali làm tăng quá trình đồng hóa acid oxalic ở Asp. niger. Hàm lượng kali trong MT rất thấp sẽ làm giảm sự tiêu thụ đường của loài nấm này [36].
Canxi có ảnh hưởng quan trọng lên sự chuyển hóa nitơ, carbohydrate, phospho. Ion Ca2+ có vai trò điều chỉnh pH trong MT. Canxi hoạt hóa một số enzyme như lipase, adenosine triphosphatase,... Canxi còn là cofactor của α-amylase. Tuy nhiên, nó có thể ức chế một số enzyme hoạt hóa bởi magiê [36].
Sắt là thành phần của các enzyme oxy hóa-khử và còn là thành phần của một số CKS [36].
Đồng cũng là một nguyên tố đóng vai trò rất quan trọng trong trao đổi chất của VSV. Người ta đã chứng minh rằng đồng và sắt hoạt động trái ngược nhau trong quá trình sinh tổng hợp CKS. Sắt cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp penicillin. Ngược lại, khi thêm CuSO4 vào MT sẽ ức chế sự tổng hợp CKS. Fe2(SO4)3 loại bỏ tác dụng ức chế của đồng trong quá trình sinh tổng hợp penicillin [36].
Kẽm là thành phần cấu tạo của một số enzyme (phosphatase, enolase, polypeptidase). Kẽm còn ảnh hưởng đến sự chuyển hóa carbohydrate, nitơ, phospho và ảnh hưởng đến quá trình oxy hóa – khử. Kẽm ảnh hưởng đến sự hấp thu các acid hữu cơ của NS. Nó làm tăng tổng hợp một số CKS (chloramphenicol, streptomycin, penicillin,...) [2], [10], [36].
Nhiệt độ ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme, hoạt động của các hệ thống vận chuyển, và những chức năng sinh lí, sinh hóa quan trọng của tế bào. NS chỉ sinh trưởng và sinh tổng hợp CKS trong những điều kiện nhiệt độ thích hợp [36]. Nhìn chung, NS phát triển thuận lợi ở nhiệt độ khoảng 30oC. Tuy nhiên, trong lên men sản xuất penicillin, ở nhiệt độ 30oC, sự phân hủy penicillin diễn ra mạnh mẽ. Do đó, người ta thường nhân giống ở nhiệt độ 30oC, sang giai đoạn lên men người ta lại áp dụng một trong hai chế độ nhiệt. Chế độ thứ nhất, duy trì nhiệt độ lên men trong khoảng 25 – 27oC. Chế độ thứ hai, giai đoạn lên men ban đầu tiến hành ở 30oC cho đến khi hệ sợi nấm phát triển đạt yêu cầu thì chuyển sang lên men ở nhiệt độ 22 – 25oC. Trong sản xuất griseofulvin, người ta tiến hành lên men ở 25oC [2], [10].
pH môi trường đóng vai trò rất quan trọng đối với sinh trưởng, đặc điểm trao đổi chất, và chính vì vậy đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp CKS. Nồng độ H+ hoặc OH- có thể ảnh hưởng trực tiếp đến tế bào hoặc ảnh hưởng trực tiếp bằng cách làm thay đổi khả năng phân li của các chất trong MT [36].
Hầu hết NS có thể sinh trưởng ở MT có pH từ 4,5 – 5. Khi nấm sinh trưởng, pH của MT thay đổi phụ thuộc vào thành phần các chất có trong MT và đặc điểm sinh lí của NS. Khi MT bị acid hóa hoặc kiềm hóa có thể ức chế sinh trưởng của VSV và làm dừng quá trình tổng hợp CKS. Do đó, MT nuôi cấy VSV cần được điều chỉnh pH trong giới hạn cho phép sinh tổng hợp CKS trong quá trình nuôi cấy [36]. Tùy từng chủng sản xuất KS mà giá trị pH thích hợp sẽ khác nhau. pH thích hợp cho sinh tổng hợp penicillin là 6,2 – 6,8; pH thích hợp cho sinh tổng hợp griseofulvin là 6,8 – 7,2 [2], [10].
∗Các phương pháp nuôi cấy NS
Trong điều kiện hiện nay, ở mức độ sản xuất công nghiệp, phương pháp nuôi cấy các chủng sinh KS cũng như các chất có hoạt tính sinh học khác thường được thực hiện bằng phương pháp nuôi cấy chìm [10].
- Lên men theo mẻ: Cả quá trình phát triển của VSV diễn ra trong một nồi lên men, sau khi giải phóng dịch lên men của mẻ trước, rửa sạch, cho MT lên men mới, sau khi thanh trùng lại tiếp tục lên men mẻ mới [10].
- Lên men có bổ sung: nuôi cấy VSV trong nồi lên men chỉ có 30 - 60% thể tích dịch lên men, sau một thời gian lên men nhất định, bổ sung thêm lượng MT mới cho đủ 100% thể tích MT lên men [10].
- Lên men nhiều bình lên men: VSV được phát triển trong các bình lên men liên tiếp. Dịch nuôi cấy của một giai đoạn phát triển nhất định của VSV sẽ được chuyển từ nồi lên men thứ nhất sang nồi thứ hai, sau đó từ nồi thứ hai sang nồi thứ ba,… Khi nồi lên men được giải phóng, nhanh chóng bổ sung MT và cấy giống mới. Với cách nuôi cấy VSV này có thể sử dụng dung tích nồi lên men hợp lý [10].
- Lên men liên tục: VSV phát triển trong điều kiện dòng chảy của MT dinh dưỡng và dịch nuôi cấy liên tục vào và ra khỏi nồi lên men, cho phép luôn giữ sự sinh trưởng của VSV ở một giai đoạn nhất định - giai đoạn VSV sinh tổng hợp CKS cao nhất. Hiện nay, phương pháp lên men liên tục đang được nghiên cứu phát triển bằng cách các tế bào của chủng sản xuất được cố định trên các chất mang khác nhau như alginat natri, chitosan,… Ưu điểm của phương pháp này là kiểm soát được quá trình lên men, tiết kiệm được nguyên liệu sản xuất và không đòi hỏi dung tích nồi lên men lớn [10].