Chúng tôi tiến hành thử hoạt tính đối kháng của một số đĩa giấy KS chuẩn (do công ty NK-Biotek cung cấp) với B. subtilis. Bên cạnh đó, thử hoạt tính đối kháng của một khối lượng tương đương CKS thô của chủng Asp. terreus Đ1 thu trong phân đoạn n – hexan bằng phương pháp khoanh giấy lọc. Kết quả được trình bày trong bảng 3.19.
Bảng 3.19. So sánh hoạt tính của CKS thô chủng Asp. terreus Đ1 với một số CKS khác
CKS Hàm lượng (µg) Hoạt tính đối kháng, D-d (cm)
CKS thô của chủng Asp. terreus Đ1 thu từ n-hexan
2 2,30 ± 0,10 10 2,93 ± 0,07 15 3,10 ± 0,10 30 3,32 ± 0,02 Clindamycin 2 2,00 ± 0,03 Ampicillin 10 3,83 ± 0,06 Streptomycin 10 1,63 ± 0,07 Erythromycin 15 2,35 ± 0,05 Tetracyclin 30 3,50 ± 0,06 Neomycin 30 0,77 ± 0,02 Kanamycin 30 1,95 ± 0,00
Các CKS chúng tôi sử dụng để so sánh đều là các CKS có hoạt tính kháng lại VKG(+) hoặc kháng cả VKG(+) và VKG(-). Trong đó, CKS thô của chủng Asp. terreus Đ1 trong phân đoạn n-hexan có hoạt tính mạnh hơn nhiều so với một số CKS như clindamycin, streptomycin, neomycin, kanamycin; có hoạt tính yếu hơn so với ampicillin, tetracyclin. Tuy nhiên, theo kết quả được trình bày trong bảng 3.11, dịch lên men của chủng Asp. terreus Đ1 có thể kháng được MRSA và E. coli kháng ampicillin (các VK kháng KS nhóm
β-lactam). Chứng tỏ CKS của chủng Asp. terreus Đ1 có ưu điểm hơn ampicillin ở chỗ không bị phân hủy bởi enzyme lactamase.
Hình 3.32. Hoạt tính đối kháng của 30 µg CKS thô chủng Asp.
terreus Đ1
Hình 3.33. Hoạt tính đối kháng của 2 µg CKS thô chủng Asp.
terreus Đ1
Hình 3.34. Hoạt tính đối kháng của 10 µg CKS thô chủng Asp.
terreus Đ1 Hình 3.35. Hoạt tính đối kháng của 10 µg ampicillin Hình 3.36. Hoạt tính đối kháng của 15 µg erythromycin Hình 3.37. Hoạt tính đối kháng của 2 µg clindamycin 3.11. Xác định MIC của CKS từ chủng Asp. terreus Đ1
Sau khi khảo sát khả năng ức chế B. subtilis của CKS thô thu từ dung môi n-hexan, chúng tôi thu được kết quả nồng độ ức chế tối thiểu của nó trên B. subtilis là 25 µg/ml.
Asp. terreus có MIC trên B. subtilis là 50 µg/ml. Nếu so sánh thì CKS của chủng Asp. terreus có MIC thấp hơn rất nhiều.
3.12. Tinh sạch CKS 3.12.1. Sắc ký bản mỏng 3.12.1. Sắc ký bản mỏng
Chúng tôi tiến hành triển khai sắc ký CKS thu từ n-hexan (cao n-hexan) và CKS thu từ ethyl acetate (cao ethyl acetate) trên silica gel 60 F254 trong các hệ dung môi khác nhau, nhằm tìm ra hệ dung môi thích hợp để tiến hành sắc ký cột, tinh chế CKS.
Bảng 3.20. Rf của CKS từ chủng Asp. terreus Đ1 khi triển khai sắc ký trong các hệ
dung môi khác nhau
STT Hệ dung môi Rf
Cao hexan Cao ethyl acetate
1 n-hexan 0 0 2 Benzen 0,01 0,04 3 Diethyl ether 0,08 0,11 4 Chloroform 0,06 0,14 5 Ethyl acetate 0,55;0,75 0,39 6 Acetone 0,68 0,71 7 Chloroform:methanol=100:1 0,21 0,21 8 Chloroform:methanol=20:1 0,51;0,66 0,32 9 Chloroform:methanol=10:1 0,54 0,46
Theo Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), dung môi được sử dụng để bắt đầu giải li sắc ký cột là hệ dung môi có thể đẩy chất cần quan tâm lên Rf từ 0,20 đến 0,30. Do đó, đối với cao n-hexan chúng tôi chọn hệ dung môi chloroform: methanol = 100: 1 để bắt đầu quá trình giải li trong sắc ký cột. Tương tự, chúng tôi cũng chọn hệ dung môi chloroform: methanol = 100: 1 để bắt đầu quá trình giải li trong sắc ký cột cao ethyl acetate.
Hình 3.38. Hiện hình sinh học bản mỏng sắc ký trên hệ 100 chloroform: 1
methanol (cao n-hexan)
Hình 3.39. Hiện hình bằng H2SO4 bản mỏng sắc ký trên hệ 100 chloroform: 1
3.12.2. Sắc ký cột
3.12.2.1. Sắc ký cột cao hexan
Chúng tôi triển khai sắc ký cột với 265mg cao thu bằng hexan trong hệ dung môi chloroform: methanol = 100: 1, sau đó tăng dần độ phân cực của dung môi theo các tỉ lệ chloroform : methanol = 100: 2, 100: 3,… Hứng mỗi lọ thủy tinh 20 ml. Theo dõi sắc ký cột bằng sắc ký bản mỏng trong hệ dung môi chloroform:methanol tỉ lệ 10: 1. Các lọ thủy tinh có bản mỏng sắc ký tương đương nhau chúng tôi sẽ gom chung lại thành một phân đoạn. Kết quả sắc ký cột được trình bày trong bảng 3.21.
Bảng 3.21. Sắc ký cột cao n-hexan STT Phân đoạn
Đặc điểm theo dõi bằng sắc ký bản (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
mỏng
Hoạt tính kháng
khuẩn Ghi chú
1 H1 Nhiều vết - Không khảo sát
2 H2 Một vết + Khảo sát
3 H3 Nhiều vết - Không khảo sát
Chúng tôi thu được phân đoạn H2 13,8 mg có hoạt tính kháng khuẩn, chứng tỏ trong phân đoạn này có chứa CKS. Tiến hành kiểm tra độ tinh khiết của phân đoạn này, chúng tôi sắc ký bản mỏng trong 3 hệ dung môi khác nhau. Kết quả được trình bày trong bảng 3.22.
Bảng 3.22. Sắc ký bản mỏng để kiểm tra độ tinh khiết của phân đoạn H2
STT Hệ dung môi Tỉ lệ Số vết Rf
1 Chloroform:methanol 10:1 1 0,50
2 Butanol:acid acetic: nước cất 5:1:2 1 0,87
3 Ethyl acetate 100% 1 0,41
4 Acetonitril 100% 3 0,44; 0,73;0,86
Khi kiểm tra trên hệ dung môi là 100% acetonitril, phân đoạn H2 thu được tách ra thành 3 vết, chứng tỏ CKS thu được trong phân đoạn H2 chưa tinh khiết, cần tinh chế thêm. Nhưng do khối lượng của phân đoạn H2 quá ít, chỉ có 13,80 mg nên chúng tôi không thể tiếp tục tinh chế.
Hình 3.40. Hiện hình sinh học bản mỏng sắc ký phân đoạn H2 trong 100% acetonitril
3.12.2.2. Sắc ký cột cao ethyl acetate
Chúng tôi triển khai sắc ký cột với 2854,20 mg cao thu bằng ethyl acetate trong hệ dung môi 100 chloroform: 1 methanol. Sau đó tăng dần độ phân cực của dung môi theo các tỉ lệ chloroform : methanol = 100: 2, 100: 3,… Hứng mỗi lọ thủy tinh 20 ml. Theo dõi sắc ký cột bằng sắc ký bản mỏng trong hệ dung môi chloroform: acetonitril tỉ lệ 10: 1. Các lọ thủy tinh có bản mỏng sắc ký tương đương nhau chúng tôi sẽ gom chung lại thành một phân đoạn. Kết quả sắc ký cột được trình bày trong bảng 3.23.
Bảng 3.23. Sắc ký cột cao ethyl acetate STT Phân
đoạn bằng sắc ký bản mỏng Đặc điểm theo dõi kháng khuẩn Hoạt tính Ghi chú
1 E1 Có nhiều vết, có vết dơ - Không khảo sát
2 E2 Một vết + Không khảo sát
3 E3 Nhiều vết, có vết dơ - Không khảo sát
4 E4 Nhiều vết + Không khảo sát
5 E5 3 vết + Khảo sát
6 E6 Nhiều vết + Không khảo sát
7 E7 Nhiều vết - Không khảo sát
8 E8 Nhiều vết + Không khảo sát
9 E9 Nhiều vết - Không khảo sát
10 E10 Nhiều vết + Không khảo sát
11 E11 Nhiều vết - Không khảo sát (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Qua quá trình sắc ký cột cao ethyl acetate, chúng tôi thu được nhiều phân đoạn có hoạt tính đối kháng với B. subtilis, trong đó phân đoạn E5 khi kiểm tra bằng sắc ký bản mỏng trong hệ dung môi chloroform: methanol có 3 vết, ít vết nhất so với các phân đoạn khác, nên chúng tôi chọn phân đoạn E5 để tiếp tục khảo sát.
Chúng tôi tiếp tục sử dụng sắc ký bản mỏng phân đoạn E5 trên các hệ dung môi khác nhau, để tìm ra hệ dung môi thích hợp có thể tách rõ ràng các chất trong phân đoạn E5.
Bảng 3.24. Sắc ký bản mỏng phân đoạn E5 STT Hệ dung môi Tỉ lệ nhúng Số lần bản Rf chất mục tiêu Ghi chú 1 Benzen:acid acetic:
methanol 10:1:1 1 0,36 Các chất không tách nhau 2 Chloroform: acid acetic 100:1 2 0,41 Các chất tách ra không rõ
ràng
3 Chloroform: acid acetic 100:3 2 0,45 Các chất tách ra không rõ ràng 4 Chloroform:acid acetic 100:3 3 0,59 Các chất tách nhau ra; chất mục tiêu tách xa các chất khác, vết tròn, màu đồng nhất
5 Chloroform: acid acetic 100:4 3 0,68 Các chất tách ra không rõ ràng
6 Chloroform: acid acetic 100:5 1 0,46 Các chất tách ra không rõ ràng
7 Chloroform: acid acetic 100:5 3 0,75 Các chất tách ra không rõ ràng
8 Chloroform: acid acetic 100:6 1 0,54 Các chất tách ra không rõ ràng
9 Chloroform: acid acetic 100:10 1 0,82 Các chất tách ra không rõ ràng
10 Chloroform: acetonitril 20:1 3 0,74 Các chất tách ra không rõ ràng
11 Chloroform: acetonitril 100:6 3 0,62 Các chất tách ra không rõ ràng
12 Chloroform: acetonitril 9:1 3 0,65 Các chất tách ra không rõ ràng
13 Chloroform: acetonitril 4:1 3 0,88 Các chất không tách nhau ra 14 Chloroform: methanol: acetonittril 20:0,5:0,5 2 0,55 Các chất tách ra không rõ ràng 15 Chloroform: methanol: acetonittril 10:0,5:0,5 2 0,76 Các chất tách ra không rõ ràng 16 Chloroform:methanol: acetonittril 10:1:0,5 1 0,56 Các chất tách ra không rõ ràng 17 Chloroform:pyridine 100:1 2 0,4 Các chất tách ra không rõ ràng 18 Chloroform:acid acetic: methanol 10:1:0,5 1 0,94 Các chất không tách ra Trong hệ dung môi chloroform acid acetic tỉ lệ 100: 3, các chất trong phân đoạn V tách nhau rõ rệt, chất mục tiêu (màu xanh xám), thể hiện vết tròn, màu sắc đồng nhất (hình 3.42). Do đó, chúng tôi chọn hệ dung môi này để chạy sắc ký bản mỏng chế hóa.
Hình 3.42. Hiện hình hóa học bản mỏng sắc ký phân đoạn E5 trong hệ dung môi 100 chloroform: 3 acid acetic
Khi tiến hành triển khai sắc ký bản mỏng chế hóa phân đoạn E5, chúng tôi nhận thấy các vạch tách rõ nhau ra hình (3.43.). Nhưng khi hiện hình bằng H2SO4 đậm đặc, chúng tôi nhận thấy trong chất mục tiêu màu xanh xám còn xuất hiện vết màu cam. Điều này chứng tỏ, trong vạch chứa chất mục tiêu còn có chứa chất khác. Do hạn chế về thời gian và kinh phí, chúng tôi tạm dừng việc tinh chế CKS lại.
Hình 3.43. Hiện UV bản mỏng chế hóa phân đoạn E5
Như vậy, chúng tôi tiến hành tinh chế CKS theo các bước sau, và thu được 2 phân đoạn H2 và E5 có chứa CKS.
Hình 3.44. Qui trình tinh chế CKS
Nuôi chủng Asp. terreus Đ1 trên MT glucose 30g, bột đậu tương 0,5 g, cao nấm men 2,5 g, KH2PO4 1 g, MgSO4.7H2O 1 g, NaCl 1,5 g, CaCl2.2H2O 0,5 g, FeCl3.2H2O 2mg, ZnSO4.7H2O 2mg, nước cất 1 lít;
pH 5,5; nhiệt độ nuôi cấy 25oC; 108 giờ. Lọc, tách sinh khối Dịch lên men
Lắc với n-hexan, tách dung môi
n-hexan có CKS Dịch lên men sau khi lắc với n-hexan
Cô chân không ở 35oC
Cao n-hexan Sắc ký cột, trong hệ
100 chloroform: 1 methanol
Lắc với ethyl acetate, tách dung môi
Ethyl acetate có CKS
Dịch lên men sau khi lắc với (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
ethyl acetate Cô chân không
ở 35o
C H1
Cao ethyl acetate
Sắc ký cột, trong hệ 100 chloroform: 1methanol
H2 H3
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận
- Từ 58 chủng NS phân lập từ RNM Cần Giờ trong bộ sưu tập giống của PTN Sinh hóa – Vi sinh Trường ĐH Sư Phạm TP. HCM, đã tuyển chọn được chủng Đ1 có hoạt tính đối kháng rất mạnh với B. subtilis (D-d=2,74 cm) và đối kháng yếu với E. coli (D-d=1,10 cm).
- Đã nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại đến loài chủng Đ1, kết luận chủng này thuộc loài Aspergillus terreus.
- Đã khảo sát và tìm ra các điều kiện nuôi cấy thích hợp cho chủng Asp. terreus Đ1 sinh kháng sinh mạnh nhất như sau: glucose 30 g, bột đậu tương 0,5 g, cao nấm men 2,5 g,
KH2PO4 1 g, MgSO4.7H2O 1 g, NaCl 1,5 g, CaCl2.2H2O 0,5 g, FeCl3.2H2O 2 mg,
ZnSO4.7H2O 2mg, nước cất 1 lít; pH 5,5; nhiệt độ nuôi cấy 25oC; 108 giờ.
- Đã khảo sát phổ tác động của CKS từ chủng Asp. terreus Đ1: kháng rất mạnh các VKG(+)
như Staphylococcus aureus, S. aureus kháng methicillin, Streptococcus pyogenes; kháng
yếu hoặc không kháng các VKG(-) và nấm men; không kháng các loài nấm Colletotrichum
sp., Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani nhưng có khả năng kháng mạnh Phytophthora
palmivora.
- Đã xác định một số đặc điểm của CKS trong dịch lên men chủng Asp. terreus Đ1: bền
nhiệt (đến 100oC trong 40 phút hoạt tính vẫn không thay đổi), bền pH (thể hiện hoạt tính rất mạnh trong khoảng pH 4 - 7,5), bền thời gian (khi bảo quản ở 4oC, sau 16 tuần hoạt tính vẫn không thay đổi).
- Bước đầu tìm hiểu khả năng ứng dụng dịch lên men của chủng Asp. terreus Đ1 trong việc
làm giảm sinh khối P. palmivora: cho thấy MT có 10% dịch lên men làm giảm 70,16% sinh
khối P. palmivora, MT có 20% làm giảm 79,57% sinh khối P. palmivora sau 4 ngày nuôi
cấy.
- Bước đầu khảo sát để tách chiết CKS, thu được kết quả như sau:
+ Dung môi thích hợp để thu CKS là n-hexan và ethyl acetate.
+ CKS thô thu từ n-hexan có MIC là 25 µg/ml. CKS thô chủng Asp. terreus Đ1 thu từ
dung môi n-hexan có hoạt tính đối kháng với B. subtilis mạnh hơn streptomycin,
neomycin, kanamycin, erythromycin, clindamycin; yếu hơn ampicillin, tetracyclin.
+ Đã bước đầu tiến hành tinh chế CKS bằng cách sắc ký cột silica gel, thu được 2
phân đoạn H2 và E5 có hoạt tính đối kháng. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Tiếp tục tinh sạch và xác định bản chất của CKS từ chủng Asp. terreus Đ1 để làm cơ sở cho việc ứng dụng.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Khưu Phương Yến Anh (2007), Nghiên cứu khả năng sinh enzyme cellulase của một số
chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường ĐH Sư phạm TP. HCM, tr.62-63.
2. Nguyễn Văn Cách (2004), Công nghệ lên men các chất kháng sinh, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, tr.96-108.
3. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2007), Vi sinh vật học, Nhà xuất bản Giáo dục, tr.90-108.
4. Nguyễn Thành Đạt (2005), Cơ sở sinh học Vi sinh vật tập 1, Nhà xuất bản Đại học Sư phạm, tr.124-130.
5. Trần Thị Minh Định, Trần Thanh Thủy (2007), “Khảo sát đặc điểm một số chủng nấm sợi có kháng sinh chống sinh vật gây hại”, Tạp chí Khoa học Trường Đại học Sư phạm TP. HCM, 12 (46), tr.138-150.
6. Bùi Xuân Đồng (2004), Vi nấm dùng trong công nghệ sinh học, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, tr.154-160.
7. Bùi Thị Việt Hà (2006), Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh
thực vật ở Việt Nam, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, tr.3-31.
8. Đỗ Thu Hà (2004), Nghiên cứu xạ khuẩn sinh kháng sinh chống nấm phân lập từ đất
Quảng Nam – Đà Nẵng, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Hà
Nội, tr.3-30.
9. Nguyễn Thị Lan Hương (2009), Tuyển chọn và khảo sát khả năng sinh amylase của một
số chủng nấm sợi từ rừng ngập mặn Cần Giờ - TP. HCM, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư phạm TP. HCM, tr.40-64.
10. Lê Gia Hy, Khuất Hữu Thanh (2009), Cơ sở công nghệ vi sinh vật và ứng dụng, Nhà xuất bản Giáo Dục, tr.221-269.
11. Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết (2006), Thí nghiệm công nghệ sinh học – tập 2 Thí nghiệm vi sinh vật học, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia TP. HCM, tr.34.
12. Phan Thanh Phương (2007), Khảo sát khả năng sinh kháng sinh của các chủng nấm sợi
phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ Thành phố Hồ Chí Minh, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư phạm TP. HCM, tr. 22-32.
13. Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phương pháp cô lập các hợp chất hữu cơ, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia TP. HCM, tr.151-252.
14. Phạm Thị Thanh Thúy (2007), Nghiên cứu khả năng phân giải cacbuahydro của một số
chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư phạm TP. HCM, tr.67-77.
15. Trần Thị Nhã Uyên (2010), Nghiên cứu và thu nhận enzyme protease từ các chủng nấm
sợi ở rừng ngập mặn Cần Giờ, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư phạm TP. HCM, tr.56-76.
16. Võ Thị Bích Vân (2010), Nghiên cứu khả năng sinh enzyme protease của một số chủng
nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư phạm TP. HCM, tr.47-63.
17. Võ Thị Bích Viên (2009), Khảo sát đặc điểm sinh học một số nhóm nấm sợi từ rừng