Nuôi chủng Asp. terreus Đ1 trên MT6, 1% NaCl, nguồn carbon là glucose, nguồn nitơ 0,5 g bột đậu tương + 2,5 g cao nấm men, ở 25oC, pH môi trường 5,5. Sau mỗi 12 giờ khảo sát hoạt tính đối kháng với B. subtilis bằng phương pháp đục lỗ, đo pH và cân sinh khối khô, kết quả được trình bày trong bảng 3.9.
Bảng 3.9. Động học quá trình lên men của chủng Asp. terreus Đ1
STT Thời gian
(giờ) Hoạt tính đối kháng, D-d (cm) pH Sinh khối (g)
1 24 0,47 ± 0,04 5,40 ± 0,00 0,089 ± 0,001 2 36 1,72 ± 0,03 4,22 ± 0,01 0,260 ± 0,001 3 48 1,88 ± 0,02 3,84 ± 0,00 0,271 ± 0,002 4 60 1,85 ± 0,15 4,91 ± 0,00 0,440 ± 0,001 5 72 2,32 ± 0,06 4,66 ± 0,01 0,491 ± 0,001 6 84 2,22 ± 0,00 4,89 ± 0,00 0,570 ± 0,006 7 96 3,17 ± 0,04 5,93 ± 0,00 0,480 ± 0,009 8 108 4,37 ± 0,03 5,28 ± 0,00 0,460 ± 0,012 9 120 3,47 ± 0,02 5,97 ± 0,00 0,513 ± 0,009 10 132 3,50 ± 0,09 6,03 ± 0,01 0,516 ± 0,012 11 144 3,52 ± 0,09 6,00 ± 0,00 0,413 ± 0,009 12 156 3,47 ± 0,04 6,05 ± 0,00 0,403 ± 0,003 13 168 3,72 ± 0,03 6,48 ± 0,00 0,423 ± 0,009 14 180 2,87 ± 0,04 6,33 ± 0,00 0,407 ± 0,003
0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 144 156 168 180
Thời gian (giờ)
Hoạ t t ính đối k há ng D -d ( c m ) 0.000 0.500 1.000 1.500 2.000 2.500 3.000 3.500 4.000 4.500 Si nh khối (g) D-d (cm) Sinh khối (g)
Đồ thị 3.3. Động học quá trình lên men của chủng Asp. terreus Đ1
Kết quả được trình bày trong bảng 3.9 và đồ thị 3.3 cho thấy, sinh khối của chủng Asp. terreus Đ1 tăng dần từ 24 giờ đến khoảng 84 giờ, sau đó đạt trạng thái ổn định đến khoảng 132 giờ và giảm nhẹ. pH môi trường giảm trong thời gian đầu, từ pH ban đầu của MT là 5,5 giảm đến 3,84 sau 48 giờ nuôi cấy. Điều này có thể giải thích là do trong thời gian này chủng Asp. terreus Đ1 sinh trưởng tạo ra các sản phẩm trao đổi chất trung gian là acid hữu cơ tiết vào MT làm pH môi trường giảm. Sau 48 giờ, pH môi trường tăng dần.
Hoạt tính đối kháng của chủng NS nghiên cứu tăng dần sau 24 giờ, đạt mức rất mạnh sau 96 giờ nuôi cấy và đạt cực đại ở 108 giờ (hình 3.15), sau đó giảm nhẹ và giữ trạng thái ổn định cho đến 168 giờ. Sau 168 giờ nuôi cấy, hoạt tính đối kháng giảm mạnh. Như vậy, CKS được tạo ra từ pha log trong quá trình sinh trưởng. Tuy nhiên, trong pha log NS chủ yếu sinh trưởng và tạo ra các sản phẩm trao đổi chất bậc I, nên nó thể hiện hoạt tính đối kháng yếu. Khi bước vào pha cân bằng (sau 84 giờ nuôi cấy), hoạt tính đối kháng tăng lên nhanh chóng. CKS được tạo ra nhiều nhất trong pha cân bằng của quá trình sinh trưởng của NS. Điều này có thể giải thích là do CKS là sản phẩm trao đổi chất bậc II (sản phẩm trao đổi chất thứ cấp), nên nó không được tổng hợp đồng thời với quá trình sinh trưởng. Sản phẩm trao đổi chất bậc II được tổng hợp sau quá trình sinh trưởng. Hoạt tính đối kháng của chủng NS nghiên cứu, duy trì khá ổn định và rất mạnh trong khoảng thời gian khá dài, từ 96 giờ đến 168 giờ, tạo điều kiện thuận lợi cho việc thu nhận CKS một cách linh động về thời gian. Khi sinh khối của NS giảm, thì hoạt tính đối kháng của nó cũng giảm. Có thể, trong giai
đoạn này, chất dinh dưỡng trong MT nuôi cấy bắt đầu cạn kiệt, các sản phẩm trao đổi chất được sinh ra nhiều, không còn nguyên liệu cho quá trình sinh tổng hợp CKS. Và cũng có thể, trong giai đoạn này trong MT nuôi cấy xuất hiện các chất làm phân hủy một phần CKS.
Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Phan Thanh Phương (2007), các chủng NS tác giả này nghiên cứu cho hoạt tính KS mạnh nhất dao động trong khoảng từ ngày thứ 5 đến ngày thứ 6.
Khi chủng Asp. terreus Đ1 cho hoạt tính đối kháng mạnh nhất, đường kính vòng vô khuẩn D-d = 4,37 cm. So sánh với nghiên cứu của Phan Thanh Phương (2007) về NS phân lập từ RNM Cần Giờ sinh KS (D-d dao động từ 2,60 - 3,20 cm), đường kính vòng vô khuẩn của chủng Asp. terreus Đ1 lớn hơn nhiều. Có thể tạm kết luận hoạt tính đối kháng của chủng Asp. terreus Đ1 mạnh hơn so với các chủng NS do Phan Thanh Phương (2007) nghiên cứu.
Theo kết quả của bảng 3.1 và bảng 3.9, chúng ta thấy sau khi tìm các điều kiện thích hợp cho sinh tổng hợp CKS, hoạt tính đối kháng của chủng Asp. terreus Đ1 tăng lên nhiều (D-d = 4,37 cm) so với hoạt tính đối kháng của chủng này lúc khảo sát sơ bộ bằng phương pháp khối thạch (D-d = 2,74 cm).
48 giờ 108 giờ
Hình 3.15. Hoạt tính đối kháng của chủng Asp. terreus Đ1 ở thời gian nuôi cấy
khác nhau 3.4. Khảo sát enzyme ngoại bào
Sau khi khảo sát các điều kiện thích hợp cho sinh trưởng và hoạt tính đối kháng của chủng Asp. terreus, chúng tôi nhận thấy chủng NS có hoạt tính đối kháng rất mạnh. Để làm cơ sở cho việc hướng tới ứng dụng, chúng tôi khảo sát thêm khả năng sinh enzyme chitinase và protease của chủng NS này.
Bảng 3.10. Hoạt tính enzyme ngoại bào của chủng Asp. terreus Đ1
1 Chitinase 2,00 ± 0,10
2 Protease 2,01 ± 0,03
Chitinase Protease
Hình 3.16. Hoạt tính enzyme của chủng Asp. terreus Đ1
Kết quả được trình bày ở bảng 3.10 cho thấy chủng Asp. terreus Đ1 có khả năng sinh 2 loại enzyme khảo sát là chitinase và protease ở mức khá mạnh. Enzyme chitinase có chức năng phân giải chitin. Chitin có mặt trong thành tế bào nấm, vỏ giáp xác và côn trùng. Enzyme protease phân giải protease. Protein có mặt trong màng tế bào và chiếm đến khoảng 50% khối lượng khô của tế bào. Do đó, hoạt tính enzyme chitinase và protease khá mạnh của chủng Asp. terreus Đ1 sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho khả năng đối kháng với các VSV gây bệnh của chủng này.
3.5. Khảo sát khả năng kháng khuẩn
Từ những kết quả trên cho thấy chủng Asp. terreus Đ1 không những có hoạt tính đối kháng rất mạnh, mà còn sinh enzyme khá mạnh. Những đặc điểm này thể hiện tiềm năng ứng dụng của chủng Asp. terreus Đ1. Do đó, chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng đối kháng của chủng Asp. terreus Đ1 với một số VK và nấm men gây bệnh cho người, cho cây trồng, trong đó có cả VK kháng thuốc. Kết quả được trình bày trong bảng 3.11.
Bảng 3.11. Khả năng đối kháng với một số VK của chủng Asp. terreus Đ1
STT Vi khuẩn Hoạt tính đối kháng,
D-d (cm) 1 Staphylococcus aureus 3,28 ± 0,03 2 Streptococcus pyogenes 3,72 ± 0,02 3 Pseudomonas aeruginosa 0,00 ± 0,00 4 S. aureus kháng methicillin 3,48 ± 0,10 5 E. coli kháng ampicillin 1,47 ± 0,07 6 Ralstonia solanacearum 0,00 ± 0,00
Kết quả cho thấy chủng Asp. terreus Đ1 có khả năng đối kháng rất mạnh với S. aureus, Str. pyogenes, S. aureus kháng methicillin (MRSA); có khả năng kháng E. coli
kháng ampicillin ở mức yếu; không kháng P. aeruginosa, R. solanacearum và nấm men C. albicans.
Nhìn chung CKS của chủng Asp. terreus Đ1 có khả năng kháng mạnh VKG(+), kháng yếu hoặc không kháng VKG(-), không kháng nấm men. Trong đó, CKS của chủng Asp. terreus Đ1 có khả năng kháng rất mạnh MRSA (hình 3.17), gây bệnh nhiễm trùng thường gặp và khó chữa.
Hình 3.17. Khả năng đối kháng với S.
aureus của chủng Asp. terreus Đ1 Hình 3.18MRSA của chủng Asp. terreus Đ1 . Khả năng đối kháng với
3.6. Khảo sát khả năng kháng nấm
Bên cạnh việc khảo sát khả năng đối kháng của chủng Asp. terreus Đ1, chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng kháng nấm của chủng này với một số nấm gây bệnh cây trồng. Kết quả được trình bày trong bảng 3.12.
Bảng 3.12. Khả năng đối kháng với một số nấm gây bệnh cây trồng của chủng Asp.
terreus Đ1
STT Nấm kiểm định Khả năng đối kháng
1 Phytophthora palmivora +
2 Colletotrichum sp. -
3 Fusarium oxysporum -
4 Rhizoctonia solani -
5 Candida albicans -
Hình 3.19. Khả năng đối kháng với P. palmivora của chủng Asp. terreus Đ1
Hình 3.20. Khả năng đối kháng với Colletotrichum sp. của chủng Asp. terreus
Đ1
Kết quả được trình bày trong bảng 3.12 cho thấy CKS của Asp. terreus Đ1 có khả năng kháng nấm P. palmivora, nhưng không có khả năng kháng các nấm gây bệnh còn lại:
Colletotrichum sp., Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani, Candida albicans.
Nấm Phytophthora là loại nấm rất nguy hiểm, gây bệnh cho nhiều loại cây trồng như tiêu, cà phê, táo, chôm chôm, cà chua, khoai tây, thuốc lá, rau, đậu, bông vải… Các loài nấm thuộc chi này gây bệnh khó chữa, làm thiệt hại nghiêm trọng năng suất cây trồng. P. palmivora ký sinh gây hại trên nhiều loại hoa màu, cây ăn quả,… Trên cây sầu riêng, loại nấm này có thể tấn công ở tất cả các bộ phận từ rễ, thân, lá, hoa và trái. Dịch bệnh có thể gặp từ vườn ươm đến cây đang thu hoạch. Loài nấm này có thể gây bệnh thối rễ, chảy nhựa thân, thối trái.
Chủng Asp. terreus Đ1 có khả năng đối kháng với P. palmivora cho thấy nó có tiềm năng ứng dụng trong kiểm soát bệnh do nấm này gây ra.
Kết luận: chủng Asp. terreus có khả năng đối kháng mạnh với các VKG(+), trong đó có cả VKG(+) kháng thuốc; không có khả năng đối kháng với các VKG(-), nấm men; có khả năng đối kháng với P. palmivora; không có khả năng đối kháng với các nấm gây bệnh cây trồng khác.
ĐC TN
3.7. Một số yếu tố ảnh hưởng đến độ bền CKS của chủng Asp. terreus Đ1
Từ những khảo sát trên cho thấy chủng Asp. terreus Đ1 có hoạt tính đối kháng rất mạnh, có nhiều tiềm năng ứng dụng. Do đó, chúng tôi tiến hành khảo sát các đặc tính lí hóa của CKS từ chủng NS này để làm cơ sở cho việc ứng dụng và tách chiết CKS.
3.7.1. Độ bền nhiệt
Độ bền nhiệt là một tính chất quan trọng của CKS, CKS bền nhiệt sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho các thao tác trong quá trình tách chiết có sử dụng nhiệt, giúp quá trình tách chiết dễ dàng hơn, ít hoặc không làm mất hoạt tính của CKS. Chúng tôi xử lí dịch lên men ở các điều kiện nhiệt độ 40 – 100oC, trong khoảng thời gian từ 10 – 60 phút. Sau đó, kiểm tra hoạt tính đối kháng với B. subtilis bằng phương pháp đục lỗ. Kết quả được trình bày trong bảng 3.13.
Bảng 3.13. Độ bền nhiệt của CKS chủng Asp. terreus Đ1
Nhiệt độ (oC) Thời gian (phút) 30 40 60 80 100 Hoạt tính đối kháng, D-d (cm) 10 4,22 ± 0,03 4,27 ± 0,02 4,18 ± 0,08 4,18 ± 0,04 4,18 ± 0,02 20 4,23 ± 0,02 4,17 ± 0,11 4,20 ± 0,00 4,17 ± 0,03 40 4,15 ± 0,00 4,23 ± 0,07 4,15 ± 0,05 4,12 ± 0,02 60 4,15 ± 0,03 4,12 ± 0,07 4,07 ± 0,02 3,83 ± 0,07
Kết quả được trình bày trong bảng 3.13 cho thấy dịch lên men từ chủng Asp. terreus
Đ1 có hoạt tính đối kháng rất mạnh ở tất cả các nhiệt độ và thời gian xử lí. Khi xử lí ở 100oC trong 40 phút, hoạt tính đối kháng của chủng này vẫn không giảm so với ở nhiệt độ phòng. Đến 100oC trong 60 phút hoạt tính đối kháng của chủng này giảm nhẹ, nhưng vẫn ở mức rất mạnh.
100oC trong 40 phút 100oC trong 60 phút
Hình 3.21. Hoạt tính đối kháng của chủng Asp. terreus Đ1 khi xử lí ở các nhiệt
độ khác nhau
3.7.2. Độ bền pH
Điều chỉnh pH dịch lên men từ chủng Asp. terreus Đ1 về các giá trị pH từ 4,0 – 7,5 trong khoảng thời gian 1 giờ. Sau đó, điều chỉnh pH về 7, và thử hoạt tính đối kháng bằng phương pháp đục lỗ. Kết quả được trình bày trong bảng 3.14.
Bảng 3.14. Độ bền pH của CKS chủng Asp. terreus Đ1
STT pH Hoạt tính đối kháng, D-d (cm) 1 4,0 4,03 ± 0,07 2 4,5 4,02 ± 0,07 3 5,0 4,02 ± 0,03 4 5,5 4,12 ± 0,06 5 6,0 4,10 ± 0,05 6 6,5 4,15 ± 0,03 7 7,0 4,10 ± 0,05 8 7,5 4,10 ± 0,03 9 Đối chứng 4,22 ± 0,03
0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 pH H oạ t t ính đối k há ng D -d ( c m )
Đồ thị 3.4. Độ bền pH của CKS của chủng Asp. terreus Đ1
Kết quả được trình bày trong bảng 3.14 và đồ thị 3.4 cho thấy dịch lên men từ chủng
Asp. terreus Đ1 có hoạt tính đối kháng rất mạnh ở tất cả các điều kiện pH khảo sát từ 4 - 7,5. CKS của chủng này hoạt động mạnh trong một giới hạn pH rộng, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình tách chiết cũng như ứng dụng. Trong quá trình tách chiết có thể sử dụng một số hóa chất có thể làm thay đổi pH, CKS hoạt động mạnh ở giới hạn pH rộng giúp chúng ta khi tách chiết có thể sử dụng hóa chất hỗ trợ mà không sợ mất hoạt tính. Đặc biệt, trong ứng dụng CKS chúng ta không thể kiểm soát được pH, khi đó đặc điểm hoạt động trong một giới hạn pH rộng là một đặc điểm đáng quý.
pH = 5,5 Không xử lí pH
Hình 3.22. Hoạt tính đối kháng của chủng Asp. terreus Đ1 khi xử lí ở các điều
kiện pH khác nhau
3.7.3. Độ bền thời gian
Chúng tôi tiến hành khảo sát độ bền thời gian của CKS trong dịch lên men của chủng
Asp. terreus Đ1 bằng cách bảo quản dịch lên men ở điều kiện nhiệt độ 4oC, sau các khoảng thời gian 1 tuần, 2 tuần, 3 tuần,… khảo sát lại hoạt tính đối kháng với B. subtilis, kết quả được trình bày trong bảng 3.15.
Bảng 3.15. Ảnh hưởng của thời gian lên hoạt tính đối kháng của dịch lên men chủng
Asp. terreus Đ1
STT Thời gian (tuần) Hoạt tính đối kháng, D-d (cm)
1 0 3,03 ± 0,02 2 1 3,07 ± 0,04 3 2 3,10 ± 0,03 4 3 2,90 ± 0,00 5 4 3,12 ± 0,04 6 5 3,13 ± 0,03 7 16 2,98 ± 0,04
0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
Thời gian (tuần)
H oạ t t ính đối k há ng, D -d (c m )
Đồ thị 3.5. Ảnh hưởng của thời gian lên hoạt tính đối kháng của dịch lên men
chủng Asp. terreus Đ1
Độ bền thời gian của CKS là một thuộc tính quan trọng của CKS, thể hiện tiềm năng ứng dụng của nó. Bởi vì từ khi lên men, thu dịch lên men và tách chiết CKS sẽ mất nhiều thời gian. Kết quả trong bảng 3.15 và đồ thị 3.5 cho thấy hoạt tính đối kháng của dịch lên men chủng Asp. terreus Đ1 duy trì ổn định theo thời gian khi được bảo quản ở điều kiện nhiệt độ 4oC. Sau thời gian bảo quản 16 tuần, hoạt tính đối kháng vẫn duy trì ở mức rất mạnh và tương đương với lúc ban đầu. Đây là một đặc điểm có giá trị trong việc hướng tới ứng dụng CKS từ chủng này.
Ban đầu Sau 16 tuần
Hình 3.23. Hoạt tính đối kháng của chủng Asp. terreus Đ1 sau các khoảng
thời gian bảo quản khác nhau
3.8. Bước đầu tìm hiểu khả năng ứng dụng dịch lên men của chủng Asp. terreus Đ1 làm giảm sinh khối nấm P. palmivora giảm sinh khối nấm P. palmivora
Chúng tôi tiến hành tìm hiểu khả năng ứng dụng dịch lên men của chủng Asp. terreus
men của chủng Asp. terreus ở các nồng độ từ 0 – 20%. Sau các khoảng thời gian 2 ngày, 3 ngày, 4 ngày, kiểm tra sinh trưởng của P. palmivora bằng cách cân sinh khối khô. Kết quả được trình bày trong bảng 3.16.
Bảng 3.16. Khả năng làm giảm sinh khối P. palmivora của dịch lên men chủng Asp.
terreus Đ1 Nồng độ (%) Thời gian (ngày) 0 1 10 20 Sinh khối (g) 2 0,226 ± 0,035 0,216 ± 0,020 0,190 ± 0,003 0,166 ± 0,003