Các thí nghiệm trong luận văn được lặp lại ít nhất 3 lần. Kết quả trình bày trong luận văn là số liệu trung bình ± sai số, được tính bằng phần mềm Microsoft Excel 2007.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1. Tuyển chọn chủng NS có hoạt tính đối kháng mạnh
Chúng tôi tiến hành tuyển chọn chủng NS có hoạt tính đối kháng mạnh từ 58 chủng NS phân lập từ RNM Cần Giờ trong bộ sưu tập giống của PTN Sinh hóa – Vi sinh, bằng cách thử hoạt tính đối kháng của các chủng NS này với VK kiểm định là B. subtilis và E. coli. Kết quả được trình bày trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Hoạt tính đối kháng của các chủng NS phân lập từ RNM Cần Giờ
STT Kí hiệu chủng Hoạt tính đối kháng, D-d (cm) STT Kí hiệu chủng Hoạt tính đối kháng, D-d (cm)
B. subtilis E. coli B. subtilis E. coli
1 Đ1 2,74 1,10 30 Đ30 0,50 - 2 Đ2 - - 31 Đ31 0,75 - 3 Đ3 1,40 - 32 Đ32 - - 4 Đ4 - - 33 Đ33 - - 5 Đ5 - - 34 Đ34 0,60 - 6 Đ6 - - 35 Đ35 0,50 - 7 Đ7 0,75 - 36 Đ36 1,45 - 8 Đ8 1,45 - 37 Đ37 0,45 - 9 Đ9 1,05 - 38 Đ38 - 1,00 10 Đ10 1,00 - 39 Đ39 - 1,75 11 Đ11 1,60 - 40 Đ40 - - 12 Đ12 - - 41 Đ41 0,60 - 13 Đ13 0,60 - 42 Đ42 0,60 - 14 Đ14 0,60 - 43 Đ43 1,10 - 15 Đ15 - - 44 Đ44 1,20 0,90 16 Đ16 - - 45 Đ45 0,95 - 17 Đ17 1,10 - 46 Đ46 - - 18 Đ18 - - 47 Đ47 0,65 - 19 Đ19 - - 48 Đ48 1,50 - 20 Đ20 0,60 - 49 Đ49 1,20 - 21 Đ21 1,60 - 50 Đ50 - - 22 Đ22 0,60 - 51 Đ51 1,60 - 23 Đ23 0,90 - 52 Đ52 1,50 - 24 Đ24 - - 53 Đ53 1,70 - 25 Đ25 - - 54 Đ54 1,85 - 26 Đ26 - - 55 Đ55 - - 27 Đ27 1,70 - 56 Đ56 - - 28 Đ28 0,70 - 57 Đ57 1,80 - 29 Đ29 1,00 - 58 Đ58 1,10 -
Kết quả được trình bày trong bảng 3.1 cho thấy trong số 58 chủng NS có:
∗ 1/58 chủng đối kháng với cả B. subtilis và E. coli. 19/58 chủng không có hoạt tính đối kháng với cả B. subtilis và E. coli.
∗ 3/58 chủng có hoạt tính đối kháng với E. coli, trong đó 1/58 chủng đối kháng ở mức trung bình, 2/58 chủng đối kháng ở mức yếu.
∗ 37/58 chủng có hoạt tính đối kháng với B. subtilis. 1/58 chủng đối kháng với B. subtilis ở mức rất mạnh. 9/58 chủng đối kháng với B. subtilis ở mức trung bình. 26/58 chủng kháng B. subtilis ở mức yếu.
Chủng Đ1 có hoạt tính kháng với B. subtilis ở mức rất mạnh (D-d = 2,74 ± 0,01 cm), kháng E. coli ở mức yếu (D-d = 1,10 ± 0,00 cm). Theo Egorov (1985), CKS của chủng Đ1 được gọi là CKS phổ rộng vì có thể kháng được VKG(+) và VKG(-). CKS của chủng Đ1 kháng VKG(+) ở mức rất mạnh nên có giá trị cho những nghiên cứu tiếp theo.
Hình 3.1. Hoạt tính đối kháng với B.
subtilis của chủng Đ1 Hình 3.2. Hoạt tính đối kháng với E. coli của chủng Đ1 3.2. Đặc điểm sinh học và phân loại
Chúng tôi tiến hành định danh chủng nấm sợi Đ1 bằng cách nuôi chủng Đ1 trên MT Czapek ở 25o
C, quan sát hình dạng, màu sắc, bề mặt KL, sắc tố tiết vào MT. Làm tiêu bản quan sát hình dạng, màu sắc sợi nấm, đặc điểm cơ quan sinh sản. Kết quả được trình bày trong bảng 3.2.
Bảng 3.2. Đặc điểm phân loại chủng nấm sợi Đ1
Đặc điểm chủng Đ1 Đặc điểm phân loại chi Aspergillus theo Bùi Xuân Đồng (2004), A. Samson (1996)
- KL ban đầu có màu trắng, sau chuyển thành vàng nâu, cuối cùng chuyển thành màu nâu.
-Sợi nấm phân nhánh, không màu, có vách ngăn.
- Giá bào tử trần không phân nhánh, có phần đỉnh phình ra thành bọng hình nửa cầu.
- Khối bào tử trần đính bên ngoài thành dạng hình tia tỏa tròn.
- KL thường phát triển nhanh, có màu trắng, vàng, vàng nâu, nâu đen hoặc hơi có màu lục.
- Hệ sợi nấm gồm các sợi ngăn vách, phân nhánh, không màu, màu nhạt hoặc trong sẫm màu.
- Giá bào tử trần không có nhánh, không có hoặc ít có vách ngăn ngang, có phần đỉnh to ra thành bọng hình chùy, hình elipse hoặc hình nửa cầu. - Khối bào tử trần đính bọng có thể có các dạng hình cột, hình cầu hoặc hình tia tỏa tròn.
So sánh giữ kết quả quan sát được và đặc điểm mô tả trong khóa phân loại của Bùi Xuân Đồng (2004), A. R. Samson (1996), chúng tôi kết luận chủng Đ1 thuộc chi
Aspergillus.
Hình 3.3. Mặt trên KL chủng Đ1 (Czapek-dox, 7 ngày, 25oC)
Hình 3.5. Sợi nấm chủng Đ1 (x400) Hình 3.6. Cuống sinh bào tử chủng Đ1 (x400)
Hình 3.7. Thể bình chủng Đ1 (x400) Hình 3.8. Bào tử chủng Đ1 (x400)
Chúng tôi gửi chủng Aspergillus Đ1 đến công ty xét nghiệm Nam Khoa để định danh bằng cách giải trình tự gen 28S và so sánh với ngân hàng gen. Kết quả, trình tự gen 28S rRNA của chủng Aspergillus Đ1 như sau: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
GAAAGGGAAGCGCTTGCAACCAGACTCGCTCGCGGGGTTCAGCCGGGCTTCGG CCCGGTGTACTTCCCCGCGGGCGGGCCAGCGTCGGTTTGGGCGGCCGGTCAAAG GCCTCCGGAATGTAGCGCCCTTCGGGGCGCCTTAATGCCGGGGGTGCAATGCGG CCAGCCTGGACCGAGGAACGCGCTTCGGCACGGACGCTGGCATAATGGTTGTA AACGACCCGTCTTGAAAC
So sánh với ngân hàng gen NCBI, trình tự gen 28S rRNA của chủng Aspergillus Đ1 có độ tương đồng 100% với loài Aspergillus terreus.
Asp. terreus là loài NS phổ biến trong đất và sinh nhiều hợp chất thứ cấp có giá trị [43]. Theo Timothy G. Schimmel, Allen D. Coffman, và Sarah J. Parsons (1998), một số sản phẩm trao đổi chất có giá trị từ Asp. terreus là aspulvinone, acid asterric, asterriquinone,
butyrolactone I, citrinin, emodin, geodin, itaconate, lovastatin, questrin, sulochrin, và acid terrecyclic [49].
Masahira Nakagawa, Arika Hirota và Heiichi Sakai (1982) nghiên cứu về CKS của chủng Asp. terreus phân lập từ mẫu đất lấy từ trại chăn nuôi của Trường Đại học Osaka, đã
xác định được CKS của loài này là acid terrecyclic A, CKS phổ rộng và có khả năng kháng khối u [34].
3.3. Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện MT lên khả năng sinh trưởng và hoạt tính
đối kháng của chủng Asp. terreus Đ1
Các điều kiện nuôi cấy như thành phần MT, nguồn carbon, nguồn nitơ, pH, nhiệt độ nuôi cấy,… có ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng cũng như khả năng sinh KS của VSV nói chung, NS nói riêng. Do đó, khi nghiên cứu khả năng sinh CKS của NS, việc nghiên cứu tìm ra các điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sinh tổng hợp CKS là điều cần thiết.
3.3.1. Ảnh hưởng của MT nuôi cấy
Để tiến hành khảo sát ảnh hưởng của MT lên khả năng sinh trưởng và hoạt tính đối kháng của chủng Asp. terreus Đ1, chúng tôi nuôi chủng Asp. terreus Đ1 trên các MT khác nhau (MT1 đến MT8 như đã trình bày trong phần 2.1.), sau 6 ngày thử hoạt tính đối kháng với B. subtilis bằng phương pháp đục lỗ, kết quả được trình bày trong bảng 3.3.
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của MT nuôi cấy lên sinh trưởng và hoạt tính đối kháng của
chủng Asp. terreus Đ1
STT Môi trường Hoạt tính đối kháng, D-d (cm) Sinh khối (g)
1 MT1 1,38 ± 0,04 0,605 ± 0,026 2 MT2 1,38 ± 0,04 0,100 ± 0,012 3 MT3 1,41 ± 0,03 0,840 ± 0,064 4 MT4 0,32 ± 0,02 0,855 ± 0,003 5 MT5 0,68 ± 0,15 0,350 ± 0,006 6 MT6 3,20 ± 0,05 0,365 ± 0,003 7 MT7 1,85 ± 0,06 0,185 ± 0,020 8 MT8 1,81 ± 0,10 0,680 ± 0,000
0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 MT1 MT2 MT3 MT4 MT5 MT6 MT7 MT8 Môi trường Ho ạt tí nh đ ối k há ng , D -d (c m )
Biểu đồ 3.1. Ảnh hưởng của MT nuôi cấy lên hoạt tính đối kháng của chủng
Asp. terreus Đ1
Kết quả được trình bày trong bảng 3.3 và biểu đồ 3.1 cho thấy chủng Asp. terreus Đ1 có hoạt tính đối kháng với B. subtilis mạnh nhất khi nuôi cấy trong MT6. Ở MT4, chủng
Asp. terreus Đ1 sinh trưởng mạnh nhất nhưng lại có hoạt tính đối kháng với B. subtilis yếu nhất (hình 3.9). Điều này cho thấy khả năng sinh trưởng và sinh KS của chủng Asp. terreus
Đ1 là không đồng nhất với nhau. So với các MT khác, MT6 có thêm các loại khoáng là canxi (dưới dạng CaCl2) và kẽm (dưới dạng ZnSO4), sắt (dưới dạng FeCl3). Theo Pitt và Ugalde (1984), Clapham (1995), Rudd và Franklin-Tong (1999), Sanders và cộng sự (1999, 2002), Berridge và cộng sự (2003), canxi có vai trò quan trọng trong hệ thống truyền tín hiệu của sinh vật nhân chuẩn. Theo B.D. Shaw, H.C. Hoch (2007), canxi có vai kích thích nảy mầm của bào tử NS [41]. Theo N.S. Egorov (1985), canxi có vai trò điều chỉnh pH môi trường, canxi có ảnh hưởng quan trọng đến dinh dưỡng nitơ, carbohydrate, và dinh dưỡng phospho của VSV. Theo N.S. Egorov (1985), sắt và kẽm cần thiết cho sự sinh tổng hợp một số CKS. Có thể các loại khoáng này có tác dụng tích cực đến quá trình sinh tổng hợp CKS của chủng Asp. terreus Đ1.
MT6 cũng chính là MT mà các tác giả Masahira Nakagawa, Arika Hirota và Heiichi Sakai (1982) sử dụng khi nghiên cứu về CKS của chủng Asp. terreus phân lập từ mẫu đất lấy từ trại chăn nuôi của Trường Đại học Osaka [34].
MT3 MT4
MT6 MT7
Hình 3.9. Hoạt tính đối kháng của chủng Asp. terreus Đ1 khi được nuôi cấy
trên các MT khác nhau
3.3.2. Ảnh hưởng của nồng độ muối
Chủng Asp. terreus Đ1 được phân lập từ đất RNM, độ mặn của MT là một trong những yếu tố ảnh hưởng quan trọng đến khả năng sinh trưởng và hoạt tính đối kháng. Do đó, chúng tôi đã tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl trong MT bằng cách nuôi chủng Asp. terreus Đ1 trên MT6 thay đổi nồng độ muối từ 0 - 6%, sau 6 ngày khảo sát hoạt tính đối kháng với B. subtilis bằng phương pháp đục lỗ, kết quả được trình bày trong bảng 3.4.
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ muối lên khả năng sinh trưởng và hoạt tính đối kháng của chủng Asp. terreus Đ1
STT Nồng độ NaCl (%) Hoạt tính đối kháng, D-d (cm) Sinh khối (g) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
1 0,0 3,17 ± 0,06 0,697 ± 0,028 2 0,5 3,12 ± 0,06 0,723 ± 0,015 3 1,0 3,28 ± 0,11 0,717 ± 0,012 4 1,5 2,38 ± 0,07 0,720 ± 0,012 5 2,0 2,15 ± 0,08 0,720 ± 0,021 6 2,5 1,78 ± 0,10 0,667 ± 0,009 7 3,0 1,73 ± 0,06 0,717 ± 0,012 8 3,5 1,37 ± 0,06 0,750 ± 0,250 9 4,0 1,20 ± 0,05 0,773 ± 0,035 10 4,5 0,73 ± 0,07 0,860 ± 0,064 11 5,0 0,88 ± 0,03 0,813 ± 0,024 12 5,5 0,67 ± 0,09 0,880 ± 0,061 13 6,0 0,00 ± 0,00 0,843 ± 0,037 3.173.123.28 2.38 2.15 1.781.73 1.37 1.20 0.730.880.67 0.00 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 Nồng độ NaCl (%) H oạ t t ính đối k há ng D -d ( c m ) 0.000 0.100 0.200 0.300 0.400 0.500 0.600 0.700 0.800 0.900 1.000 Si nh khối (g) D-d (cm) Sinh khối (g)
Đồ thị 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ NaCl lên sinh trưởng và hoạt tính đối
kháng của chủng Asp. terreus Đ1
Kết quả được trình bày trong bảng 3.4 và đồ thị 3.1 cho thấy chủng Asp. terreus Đ1 có hoạt tính đối kháng mạnh trong khoảng nồng độ muối NaCl từ 0 - 1%. Khi nồng độ muối cao hơn 1%, hoạt tính đối kháng của chủng này giảm. Đến nồng độ NaCl 6% chủng Asp.
terreus Đ1 không còn hoạt tính đối kháng. Điều này có thể do hoạt tính của CKS bị kìm hãm bởi NaCl, cũng có thể khi nồng độ NaCl trong MT cao kìm hãm các enzyme tham gia trong quá trình tổng hợp CKS của chủng Asp. terreus Đ1.
Trong khi đó, khả năng sinh trưởng của chủng này tăng dần trong khoảng nồng độ NaCl từ 0 - 5,5%, và đến độ mặn MT 6%, chủng NS này vẫn có khả năng sinh trưởng, và sinh trưởng mạnh hơn so với MT không có muối. Điều này chứng tỏ chủng Asp. terreus Đ1 là chủng ưa mặn. Theo định nghĩa của Kohlmeyer và Kohlmeyer (1979), chủng Asp. terreus
Đ1 là chủng nấm biển tùy tiện vì có khả năng sinh trưởng và sinh bào tử trên cả MT có và không có muối. Điều này cho thấy, chủng Asp. terreus Đ1 có thể có nguồn gốc từ đất liền, du nhập vào môi trường RNM và thích nghi với điều kiện sinh thái ở đây.
Độ mặn trung bình của RNM Cần Giờ khoảng 1,8 – 2,0% [58]. Chủng Asp. terreus Đ1 có khả năng sinh trưởng trong giới hạn độ mặn rộng 0 – 6%, và có thể sinh trưởng ở độ mặn cao hơn nhiều so với độ mặn trung bình của RNM Cần Giờ. Tuy nhiên, kết quả này là hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu của các tác giả khác về NS phân lập từ RNM Cần Giờ.
Võ Thị Bích Viên (2009) nghiên cứu ảnh hưởng của độ mặn lên khả năng sinh trưởng, sinh enzyme và chất kháng khuẩn của 8 chủng NS thuộc 2 chi Aspergillus và Penicillium,
kết quả cho thấy cả 8 chủng NS này đều có thể sinh trưởng trên MT có nồng độ muối lên đến 10%. Trong đó có 6/8 chủng NS sinh trưởng và sinh enzyme tốt nhất ở nồng độ muối 3%. Chủng LM9A sinh trưởng mạnh nhất ở nồng độ muối 2%. Chỉ có chủng CM30P sinh trưởng và sinh KS mạnh nhất ở nồng độ muối 0% [17].
Khưu Phương Yến Anh (2007) nghiên cứu trên 4 chủng NS Asp. guamensis, Asp. fumigatus và P. oxalicum cho thấy cả 4 chủng NS này đều sinh trưởng mạnh nhất trên MT có nồng độ muối 3%, và có thể chịu đựng nồng độ muối lên đến 20% [1].
Trần Thị Nhã Uyên (2010) nghiên cứu về enzyme protease của hai chủng
Paecilomyces lilacinus và Penicillium paxalli. Kết quả cho thấy cả hai chủng NS này đều có khả năng sinh trưởng đến nồng độ muối 10% [15].
Nguyễn Thị Lan Hương (2009), nghiên cứu về khả năng sinh amylase của hai chủng
Asp. oryzae và Asp. protuberus. Kết quả nghiên cứu cho thấy chủng Asp. oryzae có khả năng sinh trưởng trong MT có độ mặn 0 – 20%. chủng Asp. protuberus có khả năng sinh trưởng trong MT có độ mặn 0 – 10% [9].
Võ Thị Bích Vân (2010) nghiên cứu về khả năng sinh protease của chủng Asp. oryzae.
1% 1,5%
5,5% 6%
Hình 3.10. Hoạt tính đối kháng của chủng Asp. terreus Đ1 trên MT có nồng
độ muối khác nhau
3.3.3. Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng carbon
Nuôi chủng Asp. terreus Đ1 trên MT6, 1% NaCl, thay đổi nguồn carbon bằng các loại đường glucose, maltose, galactose, tinh bột, lactose, rỉ đường, fructose, sucrose, sau 6 ngày khảo sát hoạt tính đối kháng với B. subtilis bằng phương pháp đục lỗ, kết quả được trình bày trong bảng 3.5.
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng carbon lên khả năng sinh trưởng và hoạt
tính đối kháng của chủng Asp. terreus Đ1
STT Nguồn carbon Hoạt tính đối kháng, D-d (cm) Sinh khối (g)
1 Glucose 3,06 ± 0,14 0,743 ± 0,043 2 Maltose 2,42 ± 0,11 0,733 ± 0,012 3 Galactose 1,13 ± 0,26 0,490 ± 0,038 4 Tinh bột 3,08 ± 0,14 0,777 ± 0,050 5 Lactose 2,88 ± 0,06 0,843 ± 0,155 6 Rỉ đường 2,87 ± 0,07 0,557 ± 0,009 7 Fructose 2,97 ± 0,04 0,740 ± 0,006 8 Sucrose 2,42 ± 0,12 0,913 ± 0,035
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
Glucose Maltose Galactose Tinh bột Lactose Rỉ đường Fructose Sucrose
Nguồn carbon H oạ t t ính đối k há ng, D -d ( cm )
Biểu đồ 3.2. Ảnh hưởng của nguồn carbon lên hoạt tính đối kháng của chủng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Asp. terreus Đ1
Kết quả được trình bày trong bảng 3.5 và biểu đồ 3.2 cho thấy chủng Asp. terreus Đ1 có khả năng sinh trưởng và có hoạt tính đối kháng trên tất cả các nguồn carbon nghiên cứu. Trong đó, chủng này có hoạt tính đối kháng rất mạnh (D-d ≥ 2,5 cm) trên các nguồn carbon là glucose, tinh bột, lactose, rỉ đường và fructose. Chủng này có hoạt tính đối kháng mạnh trên các nguồn carbon là maltose và sucrose. Hoạt tính đối kháng thể hiện yếu nhất khi chủng NS này được nuôi trên MT có nguồn carbon là galactose. Trên 2 nguồn carbon là glucose và tinh bột chủng này cho hoạt tính mạnh nhất (hình 3.11). Tuy nhiên, khi sử dụng tinh bột làm nguồn dinh dưỡng carbon, độ nhớt MT cao, gây khó khăn cho quá trình lọc,