Chúng tôi triển khai sắc ký cột với 2854,20 mg cao thu bằng ethyl acetate trong hệ dung môi 100 chloroform: 1 methanol. Sau đó tăng dần độ phân cực của dung môi theo các tỉ lệ chloroform : methanol = 100: 2, 100: 3,… Hứng mỗi lọ thủy tinh 20 ml. Theo dõi sắc ký cột bằng sắc ký bản mỏng trong hệ dung môi chloroform: acetonitril tỉ lệ 10: 1. Các lọ thủy tinh có bản mỏng sắc ký tương đương nhau chúng tôi sẽ gom chung lại thành một phân đoạn. Kết quả sắc ký cột được trình bày trong bảng 3.23.
Bảng 3.23. Sắc ký cột cao ethyl acetate STT Phân
đoạn bằng sắc ký bản mỏng Đặc điểm theo dõi kháng khuẩn Hoạt tính Ghi chú
1 E1 Có nhiều vết, có vết dơ - Không khảo sát
2 E2 Một vết + Không khảo sát
3 E3 Nhiều vết, có vết dơ - Không khảo sát
4 E4 Nhiều vết + Không khảo sát
5 E5 3 vết + Khảo sát
6 E6 Nhiều vết + Không khảo sát
7 E7 Nhiều vết - Không khảo sát
8 E8 Nhiều vết + Không khảo sát
9 E9 Nhiều vết - Không khảo sát
10 E10 Nhiều vết + Không khảo sát
11 E11 Nhiều vết - Không khảo sát
Qua quá trình sắc ký cột cao ethyl acetate, chúng tôi thu được nhiều phân đoạn có hoạt tính đối kháng với B. subtilis, trong đó phân đoạn E5 khi kiểm tra bằng sắc ký bản mỏng trong hệ dung môi chloroform: methanol có 3 vết, ít vết nhất so với các phân đoạn khác, nên chúng tôi chọn phân đoạn E5 để tiếp tục khảo sát.
Chúng tôi tiếp tục sử dụng sắc ký bản mỏng phân đoạn E5 trên các hệ dung môi khác nhau, để tìm ra hệ dung môi thích hợp có thể tách rõ ràng các chất trong phân đoạn E5.
Bảng 3.24. Sắc ký bản mỏng phân đoạn E5 STT Hệ dung môi Tỉ lệ nhúng Số lần bản Rf chất mục tiêu Ghi chú 1 Benzen:acid acetic:
methanol 10:1:1 1 0,36 Các chất không tách nhau 2 Chloroform: acid acetic 100:1 2 0,41 Các chất tách ra không rõ
ràng
3 Chloroform: acid acetic 100:3 2 0,45 Các chất tách ra không rõ ràng 4 Chloroform:acid acetic 100:3 3 0,59 Các chất tách nhau ra; chất mục tiêu tách xa các chất khác, vết tròn, màu đồng nhất
5 Chloroform: acid acetic 100:4 3 0,68 Các chất tách ra không rõ ràng
6 Chloroform: acid acetic 100:5 1 0,46 Các chất tách ra không rõ ràng
7 Chloroform: acid acetic 100:5 3 0,75 Các chất tách ra không rõ ràng
8 Chloroform: acid acetic 100:6 1 0,54 Các chất tách ra không rõ ràng
9 Chloroform: acid acetic 100:10 1 0,82 Các chất tách ra không rõ ràng
10 Chloroform: acetonitril 20:1 3 0,74 Các chất tách ra không rõ ràng
11 Chloroform: acetonitril 100:6 3 0,62 Các chất tách ra không rõ ràng
12 Chloroform: acetonitril 9:1 3 0,65 Các chất tách ra không rõ ràng
13 Chloroform: acetonitril 4:1 3 0,88 Các chất không tách nhau ra 14 Chloroform: methanol: acetonittril 20:0,5:0,5 2 0,55 Các chất tách ra không rõ ràng 15 Chloroform: methanol: acetonittril 10:0,5:0,5 2 0,76 Các chất tách ra không rõ ràng 16 Chloroform:methanol: acetonittril 10:1:0,5 1 0,56 Các chất tách ra không rõ ràng 17 Chloroform:pyridine 100:1 2 0,4 Các chất tách ra không rõ ràng 18 Chloroform:acid acetic: methanol 10:1:0,5 1 0,94 Các chất không tách ra Trong hệ dung môi chloroform acid acetic tỉ lệ 100: 3, các chất trong phân đoạn V tách nhau rõ rệt, chất mục tiêu (màu xanh xám), thể hiện vết tròn, màu sắc đồng nhất (hình 3.42). Do đó, chúng tôi chọn hệ dung môi này để chạy sắc ký bản mỏng chế hóa.
Hình 3.42. Hiện hình hóa học bản mỏng sắc ký phân đoạn E5 trong hệ dung môi 100 chloroform: 3 acid acetic
Khi tiến hành triển khai sắc ký bản mỏng chế hóa phân đoạn E5, chúng tôi nhận thấy các vạch tách rõ nhau ra hình (3.43.). Nhưng khi hiện hình bằng H2SO4 đậm đặc, chúng tôi nhận thấy trong chất mục tiêu màu xanh xám còn xuất hiện vết màu cam. Điều này chứng tỏ, trong vạch chứa chất mục tiêu còn có chứa chất khác. Do hạn chế về thời gian và kinh phí, chúng tôi tạm dừng việc tinh chế CKS lại. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 3.43. Hiện UV bản mỏng chế hóa phân đoạn E5
Như vậy, chúng tôi tiến hành tinh chế CKS theo các bước sau, và thu được 2 phân đoạn H2 và E5 có chứa CKS.
Hình 3.44. Qui trình tinh chế CKS
Nuôi chủng Asp. terreus Đ1 trên MT glucose 30g, bột đậu tương 0,5 g, cao nấm men 2,5 g, KH2PO4 1 g, MgSO4.7H2O 1 g, NaCl 1,5 g, CaCl2.2H2O 0,5 g, FeCl3.2H2O 2mg, ZnSO4.7H2O 2mg, nước cất 1 lít;
pH 5,5; nhiệt độ nuôi cấy 25oC; 108 giờ. Lọc, tách sinh khối Dịch lên men
Lắc với n-hexan, tách dung môi
n-hexan có CKS Dịch lên men sau khi lắc với n-hexan
Cô chân không ở 35oC
Cao n-hexan Sắc ký cột, trong hệ
100 chloroform: 1 methanol
Lắc với ethyl acetate, tách dung môi
Ethyl acetate có CKS
Dịch lên men sau khi lắc với
ethyl acetate Cô chân không
ở 35o
C H1
Cao ethyl acetate
Sắc ký cột, trong hệ 100 chloroform: 1methanol
H2 H3
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận
- Từ 58 chủng NS phân lập từ RNM Cần Giờ trong bộ sưu tập giống của PTN Sinh hóa – Vi sinh Trường ĐH Sư Phạm TP. HCM, đã tuyển chọn được chủng Đ1 có hoạt tính đối kháng rất mạnh với B. subtilis (D-d=2,74 cm) và đối kháng yếu với E. coli (D-d=1,10 cm).
- Đã nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại đến loài chủng Đ1, kết luận chủng này thuộc loài Aspergillus terreus.
- Đã khảo sát và tìm ra các điều kiện nuôi cấy thích hợp cho chủng Asp. terreus Đ1 sinh kháng sinh mạnh nhất như sau: glucose 30 g, bột đậu tương 0,5 g, cao nấm men 2,5 g,
KH2PO4 1 g, MgSO4.7H2O 1 g, NaCl 1,5 g, CaCl2.2H2O 0,5 g, FeCl3.2H2O 2 mg,
ZnSO4.7H2O 2mg, nước cất 1 lít; pH 5,5; nhiệt độ nuôi cấy 25oC; 108 giờ.
- Đã khảo sát phổ tác động của CKS từ chủng Asp. terreus Đ1: kháng rất mạnh các VKG(+)
như Staphylococcus aureus, S. aureus kháng methicillin, Streptococcus pyogenes; kháng
yếu hoặc không kháng các VKG(-) và nấm men; không kháng các loài nấm Colletotrichum
sp., Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani nhưng có khả năng kháng mạnh Phytophthora
palmivora. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Đã xác định một số đặc điểm của CKS trong dịch lên men chủng Asp. terreus Đ1: bền
nhiệt (đến 100oC trong 40 phút hoạt tính vẫn không thay đổi), bền pH (thể hiện hoạt tính rất mạnh trong khoảng pH 4 - 7,5), bền thời gian (khi bảo quản ở 4oC, sau 16 tuần hoạt tính vẫn không thay đổi).
- Bước đầu tìm hiểu khả năng ứng dụng dịch lên men của chủng Asp. terreus Đ1 trong việc
làm giảm sinh khối P. palmivora: cho thấy MT có 10% dịch lên men làm giảm 70,16% sinh
khối P. palmivora, MT có 20% làm giảm 79,57% sinh khối P. palmivora sau 4 ngày nuôi
cấy.
- Bước đầu khảo sát để tách chiết CKS, thu được kết quả như sau:
+ Dung môi thích hợp để thu CKS là n-hexan và ethyl acetate.
+ CKS thô thu từ n-hexan có MIC là 25 µg/ml. CKS thô chủng Asp. terreus Đ1 thu từ
dung môi n-hexan có hoạt tính đối kháng với B. subtilis mạnh hơn streptomycin,
neomycin, kanamycin, erythromycin, clindamycin; yếu hơn ampicillin, tetracyclin.
+ Đã bước đầu tiến hành tinh chế CKS bằng cách sắc ký cột silica gel, thu được 2
phân đoạn H2 và E5 có hoạt tính đối kháng.
- Tiếp tục tinh sạch và xác định bản chất của CKS từ chủng Asp. terreus Đ1 để làm cơ sở cho việc ứng dụng.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Khưu Phương Yến Anh (2007), Nghiên cứu khả năng sinh enzyme cellulase của một số
chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường ĐH Sư phạm TP. HCM, tr.62-63.
2. Nguyễn Văn Cách (2004), Công nghệ lên men các chất kháng sinh, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, tr.96-108.
3. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2007), Vi sinh vật học, Nhà xuất bản Giáo dục, tr.90-108.
4. Nguyễn Thành Đạt (2005), Cơ sở sinh học Vi sinh vật tập 1, Nhà xuất bản Đại học Sư phạm, tr.124-130.
5. Trần Thị Minh Định, Trần Thanh Thủy (2007), “Khảo sát đặc điểm một số chủng nấm sợi có kháng sinh chống sinh vật gây hại”, Tạp chí Khoa học Trường Đại học Sư phạm TP. HCM, 12 (46), tr.138-150.
6. Bùi Xuân Đồng (2004), Vi nấm dùng trong công nghệ sinh học, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, tr.154-160.
7. Bùi Thị Việt Hà (2006), Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh
thực vật ở Việt Nam, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, tr.3-31.
8. Đỗ Thu Hà (2004), Nghiên cứu xạ khuẩn sinh kháng sinh chống nấm phân lập từ đất
Quảng Nam – Đà Nẵng, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Hà
Nội, tr.3-30.
9. Nguyễn Thị Lan Hương (2009), Tuyển chọn và khảo sát khả năng sinh amylase của một
số chủng nấm sợi từ rừng ngập mặn Cần Giờ - TP. HCM, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư phạm TP. HCM, tr.40-64.
10. Lê Gia Hy, Khuất Hữu Thanh (2009), Cơ sở công nghệ vi sinh vật và ứng dụng, Nhà xuất bản Giáo Dục, tr.221-269. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
11. Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết (2006), Thí nghiệm công nghệ sinh học – tập 2 Thí nghiệm vi sinh vật học, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia TP. HCM, tr.34.
12. Phan Thanh Phương (2007), Khảo sát khả năng sinh kháng sinh của các chủng nấm sợi
phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ Thành phố Hồ Chí Minh, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư phạm TP. HCM, tr. 22-32.
13. Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phương pháp cô lập các hợp chất hữu cơ, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia TP. HCM, tr.151-252.
14. Phạm Thị Thanh Thúy (2007), Nghiên cứu khả năng phân giải cacbuahydro của một số
chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư phạm TP. HCM, tr.67-77.
15. Trần Thị Nhã Uyên (2010), Nghiên cứu và thu nhận enzyme protease từ các chủng nấm
sợi ở rừng ngập mặn Cần Giờ, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư phạm TP. HCM, tr.56-76.
16. Võ Thị Bích Vân (2010), Nghiên cứu khả năng sinh enzyme protease của một số chủng
nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư phạm TP. HCM, tr.47-63.
17. Võ Thị Bích Viên (2009), Khảo sát đặc điểm sinh học một số nhóm nấm sợi từ rừng ngập mặn Cần Giờ TP. Hồ Chí Minh, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường ĐH Sư phạm TP. HCM, tr.70-75.
Tiếng Anh
18. A. A. Brakhage, T. Scheper (2004), Molecular Biotechnology of Fungal β-Lactam
Antibiotics and Related Peptide Synthetases - Advances in Biochemical
Engineering/Biotechnology, Volume 88, Springer Berlin Heidelberg New York, pp.47-49.
19. Benjaphorn Prapagdee, Chutima Kuekulvong, Skorn Mongkolsuk (2008), “Antifungal Potential of Extracellular Metabolites Produced by Streptomyces hygroscopicus against Phytopathogenic Fungi”, International Journal of Biological Sciences, 4, pp.330-337.
20. Carsten Christophersen, Oscar Crescente, Jens C. Frisvad, Lone Gram, Joan Nielsen, Per Halfdan Nielsen, Lisa Rahbæk (1999), “Antibacterial activity of marine- derived fungi”, Mycopathologia, 143(3), pp.135-138.
21. E. B. Gareth Jones (2011), “Fifty years of marine mycology”, Fungal Diversity, 50,
22. Emanuel Goldman, Lorrence H. Green (2008), Practical handbook of microbiology, CRC Press, pp.131-143.
23. Guangshun Wang (2010), Antimicrobial Peptides discovery Design and Novel
Therapeutic Strategies, CAB International, pp.9-10.
24. I. Edward Alcamo (1991), Fundamentals of Microbiology, The Benjamin/ Cummings,
pp.470-485.
25. Iqbal Ahmad, Farah Ahmad, John Pichtel (2011), Microbes and Microbial Technology -
Agricultural and Environmental Applications, Springer, pp.447-453.
26. J. Heritage, E. G. V. Evans, R. A. Killington (2003), Microbiology in action, Cambridge University Press, pp.249-260.
27. J. Webster, R. W. S. Weber (2007), Introduction to fungi, Cambridge University Press, pp.293-304.
28. K. Sambamurthy, Ashutosh Kar (2010), Pharmaceutical biotechnology, New Age International Publishers, p.173.
29. Kevin D. Hyde, E. B. Gareth Jones, Eduardo Leanä O, Stephen B. Pointing, Asha D. Poonyth, Lilian L. P. Vrijmoed (1998), “Role of fungi in marine ecosystems”,
Biodiversity and Conservation, 7, pp.1147-1161. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
30. Kim Lewis, Abigail A. Salyers, Harry W. Taber, Richard G. War (2002), Bacterial
Resistance to Antimicrobials, Marcel Dekker Inc, pp.331.
31. Kongkiat Trisuwan, Vatcharin Rukachaisirikul, Yaowapa Sukpondma, Sita Preedanon, Souwalak Phongpaichit, Nattawut Rungjindamai, Jariya Sakayaroj (2008), “Epoxydons and a Pyrone from the Marine-Derived Fungus Nigrospora sp. PSU- F”, Journal of Natural products, 71(8), pp.1323-1326.
32. Kyoko Adachi, Kaneo Kanoh, Puntip Wisespongp, Miyuki Nishijima, Yoshikazu Shizuri (2005), “Clonostachysins A and B, New Anti-dinoflagellate Cyclic Peptides from a Marine-derived Fungus”, The Journal of Antibiotics, 58, pp.145- 150.
33. Marie B. Coyle et al. (2005), Manual of Antimicrobial Susceptibility Testing, American Society for Microbiology, pp.3-14.
34. Masahira Nakagawa, Arika Hirota, Heiichi Sakai (1982), “Terrecyclic acid A, A new antibiotic from Aspergillus terreus”, The Journal of Antibiotics, 35(7), pp.778-
35. Micheal J. Carlite, Sarah C. Watkingson, Graham W. Gooday (2001), The fungi, Academic Press, pp.145-515.
36. N. S. Egorov (1985), Antibiotics - A scientific approach, MIR, pp.76-340.
37. P. C. Trivedi (2009), Microbes applications and effects, Aavishkar Publishers Distributors, pp.65-77.
38. Petur W. Dalsgaard, Thomas O. Larsen, Carsten Christophersen (2005), “Bioactive Cyclic Peptides from the Psychrotolerant Fungus Penicillium algidum”, The Journal of Antibiotics, 58(2), pp.141-144.
39. Quek Rop Fun (2007), A Study on Higher Marine Fungal Interaction, A Thesis
Submitted For the Degree of Master of Science, National University of Singapore, pp.4-18.
40. R. Gayatri Nambiar, K. Raveendran (2009), “Manglicolous Marine Fungi of Kerala (South India)”, Botany Research International, 2(3), pp.206-210.
41. R. J. Howard, N.A.R. Gow (2007), Biology of the Fungal Cell, 2nd Edition, Springer- Verlag Berlin Heidelberg, pp.219-230.
42. Robert A. Samson, Ellen S. Hoekstra, Jens C. Frisvad (2004), Intruduction to food and
airborne fungi, Centraalbureau voor Schimmelculture_Utrecht, pp.52-76.
43. S. Arunmozhi Balajee (2009), “Aspergillus terreus complex”, Medical Mycology, 47,
pp.42-46.
44. Shu-Wei Yang, Tze-Ming Chan, Joseph Terracciano, David Loebenberg, Mahesh Patel, Min Chu (2005), “Structure Elucidation of Sch 725674 from Aspergillus sp.”, The
Journal of Antibiotics, 58(8), pp.535-538.
45. Simone Rochfort, Joanne Ford, Simon Ovenden, Soo San Wan, Samantha George, Howard Wildman, R. Murray Tait, Barbara Meurer-Grimes, Susan Cox, Jonathan Coates, David Rhodes (2005), “A Novel Aspochalasin with HIV-1 Integrase Inhibitory Activity from Aspergillus flavipes”, The Journal of Antibiotics, 58(4),
pp.279-283.
46. Soo-Jin Choo, Hae-Ryong Park, In-Ja Ryoo, Jong-Pyung Kim, Bong-Sik Yun, Chang- Jin Kim, Kazuo Shin-ya, Ick-Dong Yoo (2005), “Deoxyverrucosidin, a Novel GRP78/BiP Down-regulator, Produced by Penicillium sp.”, The Journal of Antibiotics, 58(3), pp.210-213.
47. Stuart Hogg (2005), Essential Microbiology, John Wiley & Sons Ltd, pp.59-63, 197- 209, 353-364.
48. Takashi Fukuda, Hiroshi Tomoda, Satoshi Ōmura (2005), “Citridones, New Potentiators of Antifungal Miconazole Activity Produced by Penicillium sp. FKI-1938”, The Journal of Antibiotics, 58(5), pp.315-321.
49. Timothy G. Schimmel, Allen D. Coffman, Sarah J. Parsons (1998), “Effect of Butyrolactone I on the Producing Fungus, Aspergillus terreus”, Applied And Environmental Microbiology 64(10), pp.3707-3712.
50. V. Venkateswara Sarma, K. D. Hyde, B. P. R. Vittal (2001), “Frequency of occurrence of mangrove fungi from the east coast of India”, Hydrobiologia, 455, pp.41-53. 51. W. Scott Champney (2008), New antibiotic targets, Humana Press, pp.11-12.
52. Weizhong Liu, Qianqun Gu, Weiming Zhu, Chengbin Cui, Guotao Fan (2005), “Dihydrotrichodimerol and Tetrahydrotrichodimerol, Two New Bisorbicillinoids, from a Marine-derived Penicillium terrestre”, The Journal of Antibiotics, 58(10),
pp.621-624. Địa chỉ website 53. http://www.nihe.org.vn/new-vn/thuong-quy-va-huong-dan-ky-thuat/146/Ky-thuat- khang-sinh-do-MIC.vhtm 54. http://www.life.umd.edu/classroom/bsci424/Images/PathogenImages/BetaLactam.gif 55. http://www.ganfyd.org/images/2/2c/Streptomycin.png 56. http://cbassandchuck.pbworks.com/f/1197909289/800px-Tetracycline_structure.svg.png 57. http://www.bmb.leeds.ac.uk/mbiology/ug/ugteach/icu8/images/antibiotics/erythromycin. gif 58. http://classes.midlandstech.com/carterp/Courses/bio225/chap20/20-14_Polyenes_1.jpg 59. http://xe0.xanga.com/c37c877b45733219651823/t172158251.gif 60. http://www.bmb.leeds.ac.uk/mbiology/ug/ugteach/icu8/images/antibiotics/cephalosporin _nuc.gif 61. http://cenblog.org/_img/fumagillin.jpg 62. http://home.caregroup.org/clinical/altmed/interactions/Images/Drugs/griseofu.gif 63. http://www.vnppa.org.vn/?m=news&a=page_newsdetail&newsid=1198&leveltwo=164 &lang=vi 64. http://forum.caycanhvietnam.com/diendan/archive/index.php/t-743.html
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});