Phương pháp xác định hoạt tính KS - nghiên cứu khả- 123docz.net

 Nguyên tắc: CKS do các chủng NS sinh ra sẽ ức chế hoặc tiêu diệt các VSV kiểm định, tạo thành vòng vô khuẩn. Hoạt tính KS được sơ bộ xác định bằng kích thước vòng vô khuẩn D-d (cm). Trong đó: D là đường kính vòng vô khuẩn (cm), d là đường kính khối thạch (cm).

• D-d ≥ 2,5 cm: rất mạnh • D-d ≥ 2,0 cm: mạnh • D-d ≥ 1,5 cm: trung bình • D-d < 1,5 cm: yếu • D-d = 0: không kháng, kí hiệu (-) 2.2.1.1. Phương pháp khối thạch

Cấy NS trên MT7, ủ ở nhiệt độ phòng từ 6 ngày. Dùng khoan nút chai vô trùng khoan các khối thạch có đường kính 0,9 cm.

Chuẩn bị MT nuôi cấy VSV kiểm định (MPA: VK, Hansen: nấm men, MT khoai tây: NS), đổ MT thành một lớp mỏng lên đĩa Petri, cấy trải VSV kiểm định lên bề mặt.

Dùng kim mũi mác lấy các khối thạch chứa chủng nấm sợi RNM nghiên cứu đặt lên các đĩa thạch có VSV kiểm định.

Đặt mẫu trong tủ lạnh từ 4 - 8 giờ, sau đó ủ ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ (đối với VK), 48 - 72 giờ (đối với nấm men và NS). Xác định hoạt tính KS bằng cách đo kích thước vòng vô khuẩn D-d (cm).

2.2.1.2. Phương pháp đục lỗ

Cấy NS trong ống thạch nghiêng sau 3 ngày cho 5 ml nước cất vô trùng vào ống giống, dùng que cấy vô trùng gạt đều bào tử NS trong ống giống, sau đó lăn nhẹ trên tay để tạo thành dịch huyền phù. Dùng pipet vô trùng hút 1ml dịch huyền phù cho vào bình tam giác chứa 50 ml MT6 dịch thể. Ủ ở nhiệt độ phòng, sau 3 - 5 ngày, lọc, thu dịch lên men.

Cấy trải VSV kiểm định lên MT tương ứng (như ở mục 2.2.1.1). Dùng khoan nút chai khoan một lỗ giữa đĩa VSV kiểm định. Hút 0,1 ml dịch lên men của chủng nấm sợi RNM nghiên cứu cho vào lỗ khoan.

Đặt mẫu trong tủ lạnh từ 4 - 8 giờ, ủ ở nhiệt độ phòng 24 giờ (đối với VK), 48 - 72 giờ (đối với nấm men và NS), sau đó xác định hoạt tính KS bằng cách đo đường kính vòng vô khuẩn D-d (cm).

2.2.1.3. Phương pháp khoanh giấy lọc

Nuôi cấy NS trong các bình tam giác chứa MT7 dịch thể. Sau 6 ngày, lọc, thu dịch lên men. Dùng pipet hút 0,1 ml dịch lên men nói trên cho vào khoanh giấy lọc vô trùng có đường kính 1 cm, để khô tự nhiên hoặc sấy nhẹ ở 35oC.

Cấy trải VSV kiểm định lên MT tương ứng (như ở mục 2.2.1.1). Dùng kẹp gắp các khoanh giấy lọc có tẩm CKS, đặt lên đĩa thạch có VSV kiểm định.

Đặt mẫu trong tủ lạnh từ 4 - 8 giờ. Ủ ở nhiệt độ phòng 24 giờ (đối với VK), 48 - 72 giờ (đối với nấm men và NS), xác định hoạt tính KS bằng cách đo vòng vô khuẩn D-d (cm).

2.2.2. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme ngoại bào

Nguyên tắc: Hoạt tính enzyme được sơ bộ đánh giá qua kích thước vòng phân giải D-d

(cm). Trong đó D: đường kính vòng phân giải (cm), d: đường kính lỗ thạch (cm) • D-d ≥ 2,5 cm: rất mạnh.

• D-d ≥ 2,0 cm: khá mạnh. • D-d ≥ 1,5 cm: trung bình. • D-d <1,0 cm: yếu.

Thí nghiệm:

Nuôi NS trong bình tam giác MT bán rắn sinh tổng hợp các hệ enzyme: MT13, MT14. Sau 3 ngày, cho vào mỗi bình tam giác 100 ml nước cất vô trùng, lắc với tốc độ 200 vòng/phút trong 2 giờ, lọc qua giấy lọc và màng lọc bào tử, thu được dịch chứa enzyme thô.

Chuẩn bị MT cảm ứng sinh tổng hợp enzyme (MT15, MT16). Dùng khoan nút chai khoan một lỗ ở giữa đĩa thạch. Dùng pipet vô trùng hút 0,1 ml dịch enzyme thô cho vào lỗ thạch. Đặt ở nhiệt độ phòng 24 giờ. Nhỏ thuốc thử tương ứng (lugol đối với enzyme chitinase, HgCl2 đối với protease), đo đường kính vòng phân giải.

2.2.3. Phương pháp quan sát hình thái và định danh nấm sợi

2.2.3.1. Quan sát đại thể

Cấy NS vào ống thạch nghiêng, sau 3 ngày cho 5 ml nước cất vô trùng vào ống giống, dùng que cấy vô trùng gạt đều bào tử NS trong ống giống, sau đó lăn nhẹ trên tay để tạo thành dịch huyền phù. Dùng que cấy vô trùng nhúng nhẹ vào dịch huyền phù rồi cấy 1 điểm vào đĩa Petri có chứa MT5. Quan sát từng ngày KL về các đặc điểm sau:

• Tốc độ phát triển của KL.

• Màu sắc và sự biến đổi màu sắc của KL. • Hình dạng KL, mép KL và sợi nấm. • Giọt tiết.

• Sắc tố tiết vào MT.

2.2.3.2. Quan sát vi thể

Đặt một miếng thạch mỏng MT5 có kích thước 0,5 x 0,5 cm lên một miếng lam vô trùng đặt ở giữa đĩa Petri có một miếng giấy lọc được làm ẩm bằng nước cất vô trùng.

Sau đó cấy NS vào 2 góc đối của miếng thạch, đậy lamen lên, đậy nắp đĩa Petri lại và ủ 2 ngày. Lấy lam ra, nhỏ lactophenol hoặc xanh methylen Loffler vào giữa lam và lamen, quan sát bằng kính hiển vi ở vật kính x40 và x100 về các đặc điểm sau:

• Hình dáng sợi nấm: màu sắc, có vách ngăn hay không có vách ngăn, có phân nhánh hay không.

• Đặc điểm cơ quan sinh bào tử. • Hình dáng bào tử.

2.2.3.3. Định danh bằng sinh học phân tử

∗Thu nhận DNA

- Phá màng tế bào và màng nhân bằng protein đặc hiệu (proteinase K) để giải phóng các DNA, đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA.

- Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu: sử dụng hỗn hợp phenol và chloroform (hỗn hợp này có tác dụng làm biến tính protein) để tách riêng pha có chứa DNA. - Làm kết tủa các acid nucleic bằng ethanol hoặc isopropanol, nhằm thu được các acid nucleic dạng cô đặc, dễ bảo quản.

∗Chạy PCR (polymerase chain reaction)

Nguyên tắc: Khuyếch đại một trình tự lên nhiều lần bằng cặp mồi chuyên biệt. Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kì nối tiếp nhau, mỗi chu kì gồm 3 bước:

- Bước 1 (biến tính): trong một dung dịch đầy đủ thành phần cho sự sao chép, DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử, thường khoảng là 94oC-95oC trong vòng 30 giây - 1 phút.

- Bước 2 (lai): nhiệt độ được hạ thấp để các mồi bắt cặp với khuôn. Nhiệt độ này dao động khoảng từ 40oC – 70oC và kéo dài trong vòng 30 giây - 1 phút.

- Bước 3 (tổng hợp): nhiệt độ được tăng lên đến 72oC để DNA polymerase hoạt động tốt nhất. Thời gian của giai đoạn này phụ thuộc vào độ dài của trình tự DNA, thường kéo dài từ 30 giây đến vài phút.

∗Giải trình tự DNA

Nguyên tắc hóa học (phương pháp Maxam và Gilbert): dựa vào các phản ứng thủy giải hóa học đặc hiệu phân tử DNA, tạo thành một tập hợp nhiều phân đoạn có kích thước chênh lệch nhau một nucleotide.

Nguyên tắc enzyme học (phương pháp Sanger và các phương pháp cải biên): dựa vào sự tổng hợp mạch bổ sung cho trình tự cần xác định nhờ DNA polymerase. Với việc sử dụng thêm các dideoxynucleotide cùng với các deoxynucleotide thông thường, kết quả tổng hợp cũng là sự hình thành một tập hợp nhiều đoạn DNA có kích thước chênh nhau một nucleotide.

Ở cả hai phương pháp trên, các phân đoạn DNA sẽ được phân tách qua điện di trên gel polyacrylamid. Nếu sử dụng đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ thì kết quả trình tự cần xác định sẽ được đọc trên bản phóng xạ tự ghi từ bản điện di.

Sau khi giải trình tự gen 28S rRNA, so sánh với ngân hàng gen NCBI để định danh đến loài chủng NS nghiên cứu.

2.2.4. Phương pháp xác định sinh khối NS theo Egorov

Sinh khối NS được xác định dựa vào trọng lượng khô tuyệt đối. Lọc dịch lên men qua giấy lọc, rửa sạch sinh khối NS bằng HCl 1N và nước cất. Sấy khô tờ giấy lọc có sinh khối NS ở 80 – 105oC đến trọng lượng không đổi. Sinh khối được tính bằng sự chênh lệch trọng lượng tờ giấy lọc có sinh khối và tờ giấy lọc khô đã cân trước đó.

2.2.5. Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và khả năng sinh KS năng sinh KS

2.2.5.1. Lựa chọn MT nuôi cấy thích hợp

Nguyên tắc: Thành phần MT có ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và sinh KS của NS.

 Tiến hành: Nuôi chủng NS nghiên cứu trong các bình tam giác chứa 50 ml các MT1, MT2, MT3, MT4, MT5, MT6, MT7, MT8. Sau 6 ngày, thu dịch lên men.