Tinh sạch các chất trao đổi từ VSV là một quá trình phức tạp, đòi hỏi rất nhiều kỹ thuật, do các chất này rất đa dạng về cấu trúc hóa học nên trọng lượng phân tử rất khác nhau. Chúng có thể tan trong nước hoặc tan trong các dung môi hữu cơ tùy theo đặc tính của từng chất. Thường những chất tan trong dung môi hữu cơ dễ tinh sạch hơn tan trong nước. Những chất khó tinh sạch nhất là những chất dễ tan trong nước, trung tính hoặc lưỡng tính. Phương pháp trao đổi ion rất hiệu quả đối với những chất tan trong nước acid hoặc kiềm, không hiệu quả đối với những chất tan trong dung môi hữu cơ [7].
Để tách chiết CKS có hiệu quả phải lựa chọn dung môi hòa tan CKS như ethyl acetate, butanol, ethanol,… và có thể bổ sung các chất như acid oleic, acid palmitic,… để làm tăng khả năng hòa tan của CKS trong dung môi hữu cơ. Dung môi có chứa CKS được cô chân không ở nhiệt độ thấp, thường dưới 60oC để loại dung môi. CKS thô nhận được là nguyên liệu để tinh chế [7].
Kết tinh là phương pháp cơ bản nhất để tinh chế CKS và tách chiết các sản phẩm phân tích để xác định tính chất lí hóa của chúng. Sự kết tinh có thể được thực hiện bằng cách giảm nhiệt độ hoặc thay đổi dung môi. Dung môi chứa các vệt CKS cuối cùng của quá trình kết tinh có thể loại bỏ bằng cách cô chân không. Phương pháp sắc ký hấp phụ, sắc ký bản mỏng hoặc sắc ký lỏng cao áp là những phương pháp thông dụng để tinh chế và tách chiết CKS [7].
Quang phổ cộng hưởng từ hạt nhân được phát hiện vào đầu những năm 1960 và hiện nay được coi là một trong những kỹ thuật quan trọng nhất trong việc xác định cấu trúc phân tử. Cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) là một trong những dạng quang phổ học phức tạp. Khi các hạt nhân được đặt trong một từ trường, phần lớn các spin sắp xếp thẳng hàng theo phương của từ trường và nằm ở trạng thái spin thấp hơn. Bức xạ điện từ có thể gây nên sự chuyển tiếp từ trạng thái spin thấp hơn lên trạng thái spin cao hơn. Một phổ NMR là một đồ thị biểu diễn độ lớn và các dạng năng lượng được hấp thụ bởi một phân tử khi các nguyên tử của nó có sự chuyển tiếp từ trạng thái spin thấp hơn lên trạng thái spin cao hơn trong từ trường đặt vào [13].
Nhiều loại hạt nhân nguyên tử khác nhau trong phân tử, như 13C hay 1H, không hấp thu năng lượng ở cùng tần số. Thực tế, thường có các MT hóa học khác nhau tồn tại trong một phân tử, nó làm thay đổi các tần số cộng hưởng của các hạt nhân khác nhau. Bằng cách quan sát các tần số cộng hưởng từ khác nhau đo được trong kỹ thuật quang phổ NMR, thông tin về các MT hóa học khác nhau trong phân tử được thu nhận và định hướng cho việc hiểu biết về cấu trúc phân tử [7], [13].
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu
2.1.1. VSV kiểm định
•Vi khuẩn B. subtilis, E. coli nhận từ bộ sưu tập giống của PTN Vi sinh – Sinh hóa Trường ĐHSP Tp.HCM.
• C. albicans, P. aeruginosa, S. aureus nhận từ viện Pasteur.
•Vi khuẩn S. aureus kháng methicillin, E. coli kháng ampicillin, S. pyogenes nhận từ Trung tâm Sâm và Dược liệu TP. HCM.
•Vi nấm gây bệnh Phytophthora palmivora, Colletotrichum sp. nhận từ phòng thí nghiệm trường ĐH Nông Lâm Tp.HCM.
•Vi nấm gây bệnh cây trồng F. oxysporum, Rhizoctonia solani, vi khuẩn gây bệnh cây trồng Ralstonia solanacearum nhận được từ Bộ môn Bệnh cây trồng Khoa Bảo vệ thực vật, Trường Đại học Cần Thơ.
2.1.2. Hóa chất
• Các loại đường chuẩn: glucose, saccharose, lactose, maltose, fructose, galactose. • Các loại dung môi: n-hexan, n-butanol, ethyl acetate, acetone, methanol, acid acetic,…
• Các hóa chất khác: cao thịt, cao nấm men, cao malt, peptone, tinh bột, KH2PO4, K2HPO4, MgSO4. 7H2O, (NH4)2SO4, NH4NO3, NaNO2,NaNO3, NH4Cl .
2.1.3. Thiết bị và dụng cụ
Nồi hấp vô trùng (ALP, Nhật), Tủ sấy (Memmert, Đức), Máy lắc (Gerhardt, Đức), Tủ cấy vô trùng (Việt Nam), Máy li tâm (Hettich, Đức), Tủ giữ giống (SANYO, Nhật), Tủ lạnh (National, Nhật), Kính hiển vi (Olympus, Nhật), Máy chụp ảnh kỹ thuật số (Olympus, Nhật), Cân phân tích điện tử (Sartorius, Đức), Máy đo pH (Windaus, Mỹ), Tủ ấm (Sanyo, Nhật), Máy dập mẫu (Seward, Anh), Máy quang phổ (Amersham Biosciences, Thụy Điển), máy cô quay chân không (Heidolph, Đức).
2.1.4. Các MT nghiên cứu đã sử dụng
MT1.(MT khảo sát khả năng sinh tổng hợp CKS) glucose 20 g, cao nấm men 2 g, peptone 5 g, MgSO4.7H2O 0,5 g, KH2PO4 1 g, nước cất 1 lít [46], [48].
MT2.(MT khảo sát khả năng sinh tổng hợp CKS) cao malt 2,1 g, glycerol 4 g, peptone 1 g, nước cất 1 lít [45].
MT3.(MT khảo sát khả năng sinh tổng CKS)Cao nấm men 9 g, glucose 20 g, KH2PO4 1 g, MgSO4.7H2O 0,5 g, peptone 1,8 g, nước cất 1 lít [45].
MT4. (MT khảo sát khả năng sinh tổng hợp CKS) NaNO3 3 g, K2HPO4 1 g, KCl 0,5 g, MgSO4.7H2O 0,5 g, FeSO4.7H2O vết, cao nấm men 5 g, sucrose 30 g, nước cất 1 lít. [38]
MT5. Môi trường Czapek-dox (MT nuôi cấy nấm sợi RNM): NaNO3 3,5 g, K2HPO4 1,5 g, MgSO4.7H2O 0,5 g, KCl 0,5 g, FeSO4.7H2O 0,01 g, glucose 20 g, agar 20 g, nước biển 1 lít.
MT6. (MT khảo sát khả năng sinh tổng hợp CKS): glucose 30 g, bột đậu tương 2,5 g, cao
nấm men 0,5 g, KH2PO4 1 g, MgSO4.7H2O 1 g, NaCl 0,5 g, CaCl2.2H2O 0,5 g,
FeCl3.2H2O 2 mg, ZnSO4.7H2O 2 mg, nước cất 1 lít [34].
MT7. Môi trường Glucose Yeast Extract Agar (MT nuôi cấy nấm sợi RNM YEA): cao nấm
men 4 g, glucose 20 g, agar 20 g, nước biển 1 lít.
MT8. Môi trường Malt Extract Agar (MT nuôi cấy và giữ giống nấm sợi RNM MEA): cao malt 20 g, peptone 1 g, glucose 20 g, agar, nước biển 1 lít.
MT9. Môi trường MPA (MT nuôi cấy VK kiểm định): cao thịt 5 g, peptone 5 g, NaCl 5 g,
agar 20 g, nước cất 1 lít.
MT10. Môi trường NA (MT nuôi cấy VK kiểm định): cao thịt bò 3 g, peptone 3 g, bacto-
agar 15 g, nước cất 1 lít.
MT11. Môi trường Hansen (MT nuôi cấy nấm men kiểm định): glucose 50 g, peptone 10 g, K2HPO4 3 g, MgSO4.7H2O 2 g, agar 20 g, nước cất 1 lít.
MT12. Môi trường khoai tây (MT nuôi cấy NS kiểm định): khoai tây 30 g, glucose 50 g, nước cất 1 lít.
Khoai tây gọt vỏ, rửa sạch, thái hạt lựu, cho vào 1 lít nước cất, đun sôi trong 30 phút. Sau đó, lọc lấy nước. Bổ sung nước cất đủ 1 lít. Cho glucose và agar vào, đun sôi.
MT13. Môi trường bán rắn sinh tổng hợp enzyme chitinase trấu 55 g, cám 30 g, bột chitin 5 g, bã khoai mì 5 g, đường 4 g, (NH4)2HPO4 0,1 g, urê 0,2 g, CaCl2 0,1 g, KCl 0,05 g, MgSO4 0,05 g, HCl 0,05 g, độ ẩm 50 - 60%.
MT14. Môi trường bán rắn sinh tổng hợp enzyme protease 60% cám, 30% bột đậu nành, 10% bột ngô, 20- 25% trấu, độ ẩm 50 - 60%.
MT15. Môi trường cảm ứng sinh tổng hợp enzyme chitinase tương tự MT5 nhưng thay 20 g glucose bằng 20 g bột chitin.
MT16. Môi trường cảm ứng sinh tổng hợp enzyme protease tương tự MT5 nhưng thay 20 g glucose bằng 20 g casein.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp xác định hoạt tính KS
Nguyên tắc: CKS do các chủng NS sinh ra sẽ ức chế hoặc tiêu diệt các VSV kiểm định, tạo thành vòng vô khuẩn. Hoạt tính KS được sơ bộ xác định bằng kích thước vòng vô khuẩn D-d (cm). Trong đó: D là đường kính vòng vô khuẩn (cm), d là đường kính khối thạch (cm).
• D-d ≥ 2,5 cm: rất mạnh • D-d ≥ 2,0 cm: mạnh • D-d ≥ 1,5 cm: trung bình • D-d < 1,5 cm: yếu • D-d = 0: không kháng, kí hiệu (-) 2.2.1.1. Phương pháp khối thạch
Cấy NS trên MT7, ủ ở nhiệt độ phòng từ 6 ngày. Dùng khoan nút chai vô trùng khoan các khối thạch có đường kính 0,9 cm.
Chuẩn bị MT nuôi cấy VSV kiểm định (MPA: VK, Hansen: nấm men, MT khoai tây: NS), đổ MT thành một lớp mỏng lên đĩa Petri, cấy trải VSV kiểm định lên bề mặt.
Dùng kim mũi mác lấy các khối thạch chứa chủng nấm sợi RNM nghiên cứu đặt lên các đĩa thạch có VSV kiểm định.
Đặt mẫu trong tủ lạnh từ 4 - 8 giờ, sau đó ủ ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ (đối với VK), 48 - 72 giờ (đối với nấm men và NS). Xác định hoạt tính KS bằng cách đo kích thước vòng vô khuẩn D-d (cm).
2.2.1.2. Phương pháp đục lỗ
Cấy NS trong ống thạch nghiêng sau 3 ngày cho 5 ml nước cất vô trùng vào ống giống, dùng que cấy vô trùng gạt đều bào tử NS trong ống giống, sau đó lăn nhẹ trên tay để tạo thành dịch huyền phù. Dùng pipet vô trùng hút 1ml dịch huyền phù cho vào bình tam giác chứa 50 ml MT6 dịch thể. Ủ ở nhiệt độ phòng, sau 3 - 5 ngày, lọc, thu dịch lên men.
Cấy trải VSV kiểm định lên MT tương ứng (như ở mục 2.2.1.1). Dùng khoan nút chai khoan một lỗ giữa đĩa VSV kiểm định. Hút 0,1 ml dịch lên men của chủng nấm sợi RNM nghiên cứu cho vào lỗ khoan.
Đặt mẫu trong tủ lạnh từ 4 - 8 giờ, ủ ở nhiệt độ phòng 24 giờ (đối với VK), 48 - 72 giờ (đối với nấm men và NS), sau đó xác định hoạt tính KS bằng cách đo đường kính vòng vô khuẩn D-d (cm).
2.2.1.3. Phương pháp khoanh giấy lọc
Nuôi cấy NS trong các bình tam giác chứa MT7 dịch thể. Sau 6 ngày, lọc, thu dịch lên men. Dùng pipet hút 0,1 ml dịch lên men nói trên cho vào khoanh giấy lọc vô trùng có đường kính 1 cm, để khô tự nhiên hoặc sấy nhẹ ở 35oC.
Cấy trải VSV kiểm định lên MT tương ứng (như ở mục 2.2.1.1). Dùng kẹp gắp các khoanh giấy lọc có tẩm CKS, đặt lên đĩa thạch có VSV kiểm định.
Đặt mẫu trong tủ lạnh từ 4 - 8 giờ. Ủ ở nhiệt độ phòng 24 giờ (đối với VK), 48 - 72 giờ (đối với nấm men và NS), xác định hoạt tính KS bằng cách đo vòng vô khuẩn D-d (cm).
2.2.2. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme ngoại bào
Nguyên tắc: Hoạt tính enzyme được sơ bộ đánh giá qua kích thước vòng phân giải D-d
(cm). Trong đó D: đường kính vòng phân giải (cm), d: đường kính lỗ thạch (cm) • D-d ≥ 2,5 cm: rất mạnh.
• D-d ≥ 2,0 cm: khá mạnh. • D-d ≥ 1,5 cm: trung bình. • D-d <1,0 cm: yếu.
Thí nghiệm:
Nuôi NS trong bình tam giác MT bán rắn sinh tổng hợp các hệ enzyme: MT13, MT14. Sau 3 ngày, cho vào mỗi bình tam giác 100 ml nước cất vô trùng, lắc với tốc độ 200 vòng/phút trong 2 giờ, lọc qua giấy lọc và màng lọc bào tử, thu được dịch chứa enzyme thô.
Chuẩn bị MT cảm ứng sinh tổng hợp enzyme (MT15, MT16). Dùng khoan nút chai khoan một lỗ ở giữa đĩa thạch. Dùng pipet vô trùng hút 0,1 ml dịch enzyme thô cho vào lỗ thạch. Đặt ở nhiệt độ phòng 24 giờ. Nhỏ thuốc thử tương ứng (lugol đối với enzyme chitinase, HgCl2 đối với protease), đo đường kính vòng phân giải.
2.2.3. Phương pháp quan sát hình thái và định danh nấm sợi
2.2.3.1. Quan sát đại thể
Cấy NS vào ống thạch nghiêng, sau 3 ngày cho 5 ml nước cất vô trùng vào ống giống, dùng que cấy vô trùng gạt đều bào tử NS trong ống giống, sau đó lăn nhẹ trên tay để tạo thành dịch huyền phù. Dùng que cấy vô trùng nhúng nhẹ vào dịch huyền phù rồi cấy 1 điểm vào đĩa Petri có chứa MT5. Quan sát từng ngày KL về các đặc điểm sau:
• Tốc độ phát triển của KL.
• Màu sắc và sự biến đổi màu sắc của KL. • Hình dạng KL, mép KL và sợi nấm. • Giọt tiết.
• Sắc tố tiết vào MT.
2.2.3.2. Quan sát vi thể
Đặt một miếng thạch mỏng MT5 có kích thước 0,5 x 0,5 cm lên một miếng lam vô trùng đặt ở giữa đĩa Petri có một miếng giấy lọc được làm ẩm bằng nước cất vô trùng.
Sau đó cấy NS vào 2 góc đối của miếng thạch, đậy lamen lên, đậy nắp đĩa Petri lại và ủ 2 ngày. Lấy lam ra, nhỏ lactophenol hoặc xanh methylen Loffler vào giữa lam và lamen, quan sát bằng kính hiển vi ở vật kính x40 và x100 về các đặc điểm sau:
• Hình dáng sợi nấm: màu sắc, có vách ngăn hay không có vách ngăn, có phân nhánh hay không.
• Đặc điểm cơ quan sinh bào tử. • Hình dáng bào tử.
2.2.3.3. Định danh bằng sinh học phân tử
∗Thu nhận DNA
- Phá màng tế bào và màng nhân bằng protein đặc hiệu (proteinase K) để giải phóng các DNA, đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA.
- Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu: sử dụng hỗn hợp phenol và chloroform (hỗn hợp này có tác dụng làm biến tính protein) để tách riêng pha có chứa DNA. - Làm kết tủa các acid nucleic bằng ethanol hoặc isopropanol, nhằm thu được các acid nucleic dạng cô đặc, dễ bảo quản.
∗Chạy PCR (polymerase chain reaction)
Nguyên tắc: Khuyếch đại một trình tự lên nhiều lần bằng cặp mồi chuyên biệt. Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kì nối tiếp nhau, mỗi chu kì gồm 3 bước:
- Bước 1 (biến tính): trong một dung dịch đầy đủ thành phần cho sự sao chép, DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử, thường khoảng là 94oC-95oC trong vòng 30 giây - 1 phút.
- Bước 2 (lai): nhiệt độ được hạ thấp để các mồi bắt cặp với khuôn. Nhiệt độ này dao động khoảng từ 40oC – 70oC và kéo dài trong vòng 30 giây - 1 phút.
- Bước 3 (tổng hợp): nhiệt độ được tăng lên đến 72oC để DNA polymerase hoạt động tốt nhất. Thời gian của giai đoạn này phụ thuộc vào độ dài của trình tự DNA, thường kéo dài từ 30 giây đến vài phút.
∗Giải trình tự DNA
Nguyên tắc hóa học (phương pháp Maxam và Gilbert): dựa vào các phản ứng thủy giải hóa học đặc hiệu phân tử DNA, tạo thành một tập hợp nhiều phân đoạn có kích thước chênh lệch nhau một nucleotide.
Nguyên tắc enzyme học (phương pháp Sanger và các phương pháp cải biên): dựa vào sự tổng hợp mạch bổ sung cho trình tự cần xác định nhờ DNA polymerase. Với việc sử dụng thêm các dideoxynucleotide cùng với các deoxynucleotide thông thường, kết quả tổng hợp cũng là sự hình thành một tập hợp nhiều đoạn DNA có kích thước chênh nhau một nucleotide.
Ở cả hai phương pháp trên, các phân đoạn DNA sẽ được phân tách qua điện di trên gel polyacrylamid. Nếu sử dụng đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ thì kết quả trình tự cần xác định sẽ được đọc trên bản phóng xạ tự ghi từ bản điện di.
Sau khi giải trình tự gen 28S rRNA, so sánh với ngân hàng gen NCBI để định danh đến loài chủng NS nghiên cứu.
2.2.4. Phương pháp xác định sinh khối NS theo Egorov
Sinh khối NS được xác định dựa vào trọng lượng khô tuyệt đối. Lọc dịch lên men qua giấy lọc, rửa sạch sinh khối NS bằng HCl 1N và nước cất. Sấy khô tờ giấy lọc có sinh khối NS ở 80 – 105oC đến trọng lượng không đổi. Sinh khối được tính bằng sự chênh lệch trọng lượng tờ giấy lọc có sinh khối và tờ giấy lọc khô đã cân trước đó.
2.2.5. Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và khả năng sinh KS năng sinh KS
2.2.5.1. Lựa chọn MT nuôi cấy thích hợp
Nguyên tắc: Thành phần MT có ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và sinh KS của NS.
Tiến hành: Nuôi chủng NS nghiên cứu trong các bình tam giác chứa 50 ml các MT1, MT2, MT3, MT4, MT5, MT6, MT7, MT8. Sau 6 ngày, thu dịch lên men.
Kiểm tra sinh trưởng của NS bằng cách cân sinh khối khô. Kiểm tra hoạt tính KS bằng phương pháp đục lỗ.
Nguyên tắc: Độ mặn của MT có ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và sinh KS của các chủng NS.
Tiến hành: Nuôi các chủng NS nghiên cứu trong các bình tam giác chứa 50 ml MT6 bổ sung NaCl với nồng độ 0%; 0,5%; 1%; 1,5%; 2%; 2,5%; 3%; 3,5%; 4%; 4,5%; 5%; 5,5%; 6%. Sau 3 - 5 ngày, thu dịch lên men.
Kiểm tra sinh trưởng của NS bằng cách cân sinh khối khô. Kiểm tra hoạt tính KS bằng phương pháp đục lỗ.
2.2.5.3. Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng carbon
Nuôi NS trong các bình tam giác chứa 50 ml MT6 thay đường glucose bằng các đường: fructose, sucrose (saccharose), lactose, galactose, maltose, tinh bột, rỉ đường. Sau 3 - 5 ngày, thu dịch lên men.
Kiểm tra sinh trưởng của NS bằng cách cân sinh khối khô. Kiểm tra hoạt tính KS bằng phương pháp đục lỗ.
2.2.5.4. Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng nitơ
Nuôi NS trong các bình tam giác chứa 50 ml MT6 thay đổi nguồn nitơ lần lượt bằng cao thịt, cao nấm men, bột đậu tương, peptone, NH4Cl, NH4NO3, NaNO3, (NH4)2SO4. Sau 6