Phần III: Thực Nghiệm Chương 5: Hoạch Định Thí Nghiệm
5.3 HOẠCH ĐỊNH THÍ NGHIỆM
5.3.1 Thí nghiệm về phƣơng pháp quang phổ
TN 1.1: Khảo sát độ hấp thu của Phenol, Glutaraldehyde , acid H2SO4 và ethanol theo bƣớc sĩng ()
a) Mục đích:
- Xác định phổ hấp thu của Phenol, Glutaraldehyde,dung mơi acid H2SO4 đđ và ethanol
- Xác định sự ảnh hƣởng của dung mơi acid H2SO4 đđ và lƣợng dƣ Phenol đối với phức Glutaraldehyde – Phenol (Glu-Phe).
b) Nội dung:
1- Dùng máy quang phổ UV-Vis qu t bƣớc sĩng viết tắt: Quét phổ từ 190 1100nm, cell trắng là cốc rổng đối với 4 mẫu sau:
- Mẫu 1: dung dịch phenol 10 5g Phenol ethanol vđ 50ml - Mẫu 2: dd acid sulfuric: 7ml acid H2SO4đđ pha trong H2O vđ 10ml - Mẫu 3: Ethanol nguyên chất .
- Mẫu 4: dd Glutaraldehyde 0,1 pha trong ethanol
2- Qu t phổ từ 190 1100nm, cell trắng: cốc rổng đối với 4 mẫu trên.
TN 1.2: Khảo sát Abs theo của mẫu trắng a) Mục đích:
-Xác định phổ hấp thu các thành phần tạo phức nhƣng khơng cĩ Glutaraldehyde.
b) Nội dung:
1- Dùng máy quang phổ UV-Vis qu t bƣớc sĩng viết tắt: Quét phổ từ 190 1100nm, cell trắng là cốc rổng đối với 1 mẫu sau:
- Mẫu 5 : 5ml DD phenol 10% + 10ml H2O dd acid sulfuric vđ 50ml. 2- Qu t phổ từ 190 1100nm, cell so sánh: là cốc rổng.
TN 1.3: Khảo sát Abs của phức Glutaraldehyde – Phenol (Glu-Phe) theo
a) Mục đích:
- Xác định phổ hấp thu của phức Glu – Phe trong Acid H2SO4 - Xác định giá trị bƣớc sĩng hấp thu cực đại max)
b) Nội dung:
1- Qu t phổ từ 190 1100nm, cell trắng là 5ml DD phenol 10 10ml H2O dd acid sulfuric vđ 50ml đối với 1 mẫu:
- Mẫu 6: 1ml Glutaraldehyde 5ml DD phenol 10 10ml H2O + dd acid sulfuric vđ 50ml
2- Dùng phần mềm của máy để xác định max trong phổ đồ mẫu 6.
TN 1.4: Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ acid H2SO4 a) Mục đích:
- Xác định nồng độ acid H2SO4 tối ƣu cho sự tạo phức
- Đo phổ (tại max đối với các hổn hợp cĩ nồng độ acid H2SO4 thay đổi.
b) Nội dung:
1- Qu t phổ từ 190 1100nm, cell trắng là 5ml DD phenol 10 10ml H2O dd acid sulfuric vđ 50ml đối với 10 mẫu:
Mẫu 7: 1 ml DD Glu 0,04 5ml DD phenol 10 16 ml H2O + dd acid sulfuric vđ 50ml.
Mẫu 8: 1 ml DD Glu 0,04 5ml DD phenol 10 14 ml H2O + dd acid sulfuric vđ 50ml (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Mẫu 9: 1 ml DD Glu 0,04 5ml DD phenol 10 12 ml H2O + dd acid sulfuric vđ 50ml
Mẫu 10: 1 ml DD Glu 0,04 5ml DD phenol 10 10 ml H2O + dd acid sulfuric vđ 50ml
Mẫu 11: 1 ml DD Glu 0,04 5ml DD phenol 10 9 ml H2O + dd acid sulfuric vđ 50ml
Phần III: Thực Nghiệm Chương 5: Hoạch Định Thí Nghiệm
Mẫu 13: 1 ml DD Glu 0,04 5ml DD phenol 10 7 ml H2O + dd acid sulfuric vđ 50ml
Mẫu 14: 1 ml DD Glu 0,04 5ml DD phenol 10 6 ml H2O + dd acid sulfuric vđ 50ml
Mẫu 15: 1 ml DD Glu 0,04 5ml DD phenol 10 4 ml H2O + dd acid sulfuric vđ 50ml
Mẫu 16: 1 ml DD Glu 0,04 5ml DD phenol 10 2 ml H2O + dd acid sulfuric vđ 50ml
2- Dùng Excel để vẽ đồ thị hàm số viết tắt: Vẽ đồ thị Abs = f x với x là H2SO4 trong 10 mẫu trên.
TN 1.5: Khảo sát ảnh hƣởng của lƣợng dƣ phenol a) Mục đích:
- Xác định ảnh hƣởng của lƣợng dƣ Phenol đối với độ hấp thu Abs của phức Glu – Phe
- Xác định tỷ lệ thành phần của phức Glutaldehyde – Phenol. Theo lý thuyết phức Glutaraldehyde – Phenol cĩ tỷ lệ 2:1.
b) Nội dung:
1- Dùng máy quang phổ set-ref = 482nm, cell trắng: 5ml DD phenol 10 10ml H2O dd acid sulfuric vđ 50ml đo Abs tại max viết tắt: đo phổ đối với 10 mẫu:
Mẫu 17: 2 ml DD Glu 0,04 1ml DD phenol 1 37 ml dd acid sulfuric H2O vđ 50ml.
Mẫu 18: 2 ml DD Glu 0,04 2ml DD phenol 1 37 ml dd acid sulfuric H2O vđ 50ml.
Mẫu 19: 2 ml DD Glu 0,04 3ml DD phenol 1% + 37 ml dd acid sulfuric + H2O vđ 50ml.
Mẫu 20 : 2 ml DD Glu 0,04 4ml DD phenol 1 37 ml dd acid sulfuric H2O vđ 50ml.
Mẫu 22: 2 ml DD Glu 0,04 1ml DD phenol 10% + 37 ml dd acid sulfuric + H2O vđ 50ml.
Mẫu 23: 2 ml DD Glu 0,04 2ml DD phenol 10 37 ml dd acid sulfuric + H2O vđ 50ml.
Mẫu 24: 2 ml DD Glu 0,04 3ml DD phenol 10 37 ml dd acid sulfuric + H2O vđ 50ml.
Mẫu 25: 2 ml DD Glu 0,04 4ml DD phenol 10% 37 ml dd acid sulfuric + H2O vđ 50ml.
Mẫu 26: 2 ml DD Glu 0,04 5ml DD phenol 10 37 ml dd acid sulfuric + H2O vđ 50ml.
2- Dùng Excel để vẽ đồ thị hàm số viết tắt: Vẽ đồ thị Abs = f x với x là số mol phenol trong 10 mẫu trên.
TN 1.6 : Khảo sát thời gian bền màu của phức a) Mục đích:
- Xác định ảnh hƣởng của thời gian đo phổ đối với phức Glu - Phe. - Xác định khoảng giá trị t1 t2 để cĩ Abs cực đại.
b) Nội dung:
1- Đo phổ đối với mẫu 24 ở các thời điểm :
0 phút, 15 phút , 30 phút, 45 phút, 60 phút, 90 phút, 120phút,150 phút 2- Vẽ đồ thị Abs = f x với x là thời điểm đo phổ của mẫu 24.
TN 1.7: Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ Glutaraldehyde (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
a) Mục đích: Xác định hàm số tƣơng quan tuyến tính giữa Abs và nồng độ Glutaraldehyde
b) Nội dung :
1- Dùng máy quang phổ set-ref = 482nm, cell trắng: 5ml DD phenol 10 10ml H2O dd acid sulfuric vđ 50ml đo Abs tại max viết tắt: đo phổ đối với 5 mẫu:
Mẫu 27: 0 ml DD Glu 0,04 2ml DD phenol 1 37 ml dd acid sulfuric + H2O vđ 50ml.
Phần III: Thực Nghiệm Chương 5: Hoạch Định Thí Nghiệm
Mẫu 29: 1 ml DD Glu 0,04 2ml DD phenol 1 37 ml dd acid sulfuric H2O vđ 50ml.
Mẫu 30: 2 ml DD Glu 0,04 2ml DD phenol 1 37 ml dd acid sulfuric + H2O vđ 50ml.
Mẫu 31: 3 ml DD Glu 0,04 2ml DD phenol 1 37 ml dd acid sulfuric H2O vđ 50ml.
Mẫu 32: 4 ml DD Glu 0,04 2ml DD phenol 1 37 ml dd acid sulfuric H2O vđ 50ml.
2- Dùng Excel để vẽ đồ thị hàm số viết tắt: Vẽ đồ thị) Abs = f x với x là nồng độ Glutaraldehyde trong 6 mẫu trên.
5.3.2 Thí nghiệm về nội dung thẩm định
TN 2.1: Độ chọn lọc của phƣơng pháp quang phổ a) Mục đích:
- Xác định chất gây nhiễu trong phản ứng tạo phức giữa Glutaraldehyde và phenol trong acid H2SO4.
- Theo lý thuyết, các chất aldehyde khác cĩ thể gây nhiễu. Chọn chất gây nhiễu là formaldehyde.
b) Nội dung:
1- Đo phổ đối với 2 mẫu:
- Mẫu 1: Lấy 1ml DD Glu 0,04 3ml DD phenol 10 9ml H2O + dd acid sulfuric vđ 50ml.
- Mẫu 2: Lấy 1ml DD Glu 0,04% + 1ml DD Formaldehyde 0,04% + 3ml DD phenol 10% + 8ml H2O dd acid sulfuric vđ 50ml.
2- So sánh Abs của 2 mẫu trên để kết luận.
TN 2.2: Độ lặp lại của phƣơng pháp quang phổ a) Mục đích:
Xác định độ lặp lại của phƣơng pháp quang phổ. Thể hiện qua giá trị RSD. Theo yêu cầu RSD phải 2,0 .
b) Nội dung:
1- Đo phổ 6 lần đối với mẫu 24 ở thời điểm 10 20 phút. 2- Tính RSD của 6 kết quả thu đƣợc.
TN 2.3: Độ đúng của phƣơng pháp quang phổ a) Mục đích:
Xác định độ đúng của P. pháp đo phổ. Thể hiện qua giá trị tìm lại RC của Glutaraldehyde thêm vào. Theo yêu cầu RC phải ≥ 98,0 .
b) Nội dung:
1- Đo phổ đối với 3 mẫu: :
- Mẫu 1: Lấy 1ml DD Glu 0,04 3ml DD Phenol 10 37ml acid H2SO4đđ H2O vđ 50ml.
- Mẫu 2: Lấy 1ml DD Glu 0,04% + 1ml DD Gluchuẩn 0,04% + 3ml DD Phenol 10% + 37ml acid H2SO4đđ H2O vđ 50ml.
- Mẫu 3: Lấy 1ml DD Glu 0,04 2ml DD Gluchuẩn 0,04% + 3ml DD Phenol 10% + 37ml acid H2SO4đđ H2O vđ 50ml. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2- Từ Abs của 3 mẫu, tìm lại giá trị mc mol Glutaraldehyde đã thêm vào mẫu 1 3- Tính RC theo cơng thức sau:
TN 2.4: Độ tuyến tính của phƣơng pháp quang phổ a) Mục đích:
- Xác định độ tuyến tính của Pp quang phổ. Thể hiện qua hệ số tƣơng quan tuyến tính R của hàm số y = a.x b với y là Abs, x là nồng độ Glutaraldehyde thay đổi trong các mẫu .
- Theo yêu cầu R phải ≥ 0,999 .
b) Nội dung:
1- Đo phổ đối với 5 mẫu ở thời điểm 20 30 phút:
Mẫu 27: 0 ml DD Glu 0,04 2ml DD phenol 1 37 ml dd acid sulfuric H2O vđ 50ml. RC = *100% t t c m m m
Phần III: Thực Nghiệm Chương 5: Hoạch Định Thí Nghiệm
Mẫu 29: 1 ml DD Glu 0,04 2ml DD phenol 1 37 ml dd acid sulfuric H2O vđ 50ml.
Mẫu 30: 2 ml DD Glu 0,04 2ml DD phenol 1 37 ml dd acid sulfuric H2O vđ 50ml.
Mẫu 31: 3 ml DD Glu 0,04% + 2ml DD phenol 1% + 37 ml dd acid sulfuric + H2O vđ 50ml.
Mẫu 32: 4 ml DD Glu 0,04 2ml DD phenol 1 37 ml dd acid sulfuric H2O vđ 50ml.
2- Vẽ đồ thị y = a.x b. Dùng MS-Excel để tính giá trị R.
TN 2.5: Xác định LOD; LOQ và khoảng làm việc a) Mục đích: Xác định giá trị LOD; LOQ; khoảng làm việc.
b) Thực hiện: Thực hiện nhƣ trình bày ở chƣơng 2.
LOQ đƣợc khảo sát LLOQ và HLOQ để xác định khoảng làm việc. 1/ Đối với LOD:
- Pha và đo mẫu trắng 6 lần : cĩ đƣợc kết quả đo là Abs1 6 - Tính giá trị trung bình của
__
Absvà độ lệch chuẩn SD của 6 kết quả
- Tìm trên đồ thị Abs = a.CGlu b, nồng độ CGlu tƣơng ứng với giá trị AbsLOD =
__
Abs + (3 * SD . Nồng độ CGlu đĩ là LOD 2/ Đối với LOQ:
- LLOQ thực hiện tƣơng tự LOD nhƣng thay 3*SD b ng 10*SD 3/ Khoảng làm việc:
5.3.3 Thí nghiệm về đánh giá, so sánh phƣơng pháp
TN 3.1: Định lƣợng Glutaraldehyde trong nguyên liệu Protectol GA 50
Định lƣợng mẫu nguyên liệu Protectol GA 50 cĩ 50 Glutaraldehyde của BASF Chemical Co – Đức số lơ 09339756PO b ng các Pp quang phổ và chuẩn độ. Hàm lƣợng Glutaraldehyde trong nguyên liệu này trong khoảng 47,0 53,0%.
TN 3.1.1: Pp Quang phổ a) Thực hiện:
Chuẩn bị dung dịch :
- Dung dịch phenol 10 5g Phenol ethanol vđ 50ml - DD acid sulfuric: acid H2SO4đđ 98
- Ethanol nguyên chất . (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- DD Glu chuẩn: Lấy 1ml Glutaraldehyde chuẩn 97,5 w v ethanol vđ 50ml. Pha loảng 1 50 cùng dung mơi. DD cĩ nồng độ 390mg l
Chuẩn bị mẫu:
- DD mẫu thử: 3 mẫu của cùng lơ hàng.
Lấy m1>3 mg mẫu thử Ethanol vđ 100ml. Pha loảng 1 50 cùng dung mơi. Lấy 1ml 3ml DD phenol 10 37ml dd acid sulfuric H2O vđ 50ml.
- DD đ c: Lấy 1ml DD Glu chuẩn 3ml DD phenol 10 37ml dd acid sulfuric + H2O vđ 50ml. DD đ c cĩ nồng độ 7,8mg l
Đo phổ: Set-ref = 482nm, cốc so sánh: mẫu trắng. Qu t phổ từ 190 1100nm
Đọc kết quả: So sánh Abs tại max của DD thử với DD đ c để suy ra hàm lƣợng Glutaral;dehyde cĩ trong mẫu thử.
TN 3.1.2: Pp chuẩn độ
Theo British Pharmacopoeia 2007
Dissolve 2 g in 100 ml of a 7% w/v solution of hydroxylamine hydrochloride previously neutralised to bromophenol blue solution with 1M sodium hydroxide VS and allow to stand for 30 minutes. Add 20 ml of petroleum spirit (boiling range, 40° to 60° and titrate with 1M sodium hydroxide VS until the colour of the aqueous phase matches that of a 7% w/v solution of hydroxylamine hydrochloride
Phần III: Thực Nghiệm Chương 5: Hoạch Định Thí Nghiệm
previously neutralised to bromophenol blue solution with 1M sodium hydroxide VS.
Each ml of 1M sodium hydroxide VS is equivalent to 50.05 mg of C5H8O2.
Theo PTN Vemedim
Lấy chính xác 800mg mẫu thử hịa tan vào 100ml dd hydro ylamine hydrochloride 7 . ( này trước đư c trung hịa b ng dd NaOH M với ch thị bromophenol blue. Để yên 30 phút, thêm 20ml Ether dầu hỏa cĩ phân đoạn sơi 40 – 600
C . Chuẩn độ b ng dd NaOH 1M đến khi màu của lớp nƣớc tƣơng đƣơng với màu của dd hydroxylamine hydrochloride 7% đã trung hịa trƣớc đĩ.
1ml dd NaOH 1M 50,05mg Glutaraldehyde a) Thực hiện:
Chuẩn độ 3 mẫu theo Pp nhƣ trên.
TN 3.2: Định lƣợng Glutaraldehyde trong thành phẩm
TN 3.2.1: Pp Quang phổ a) Thực hiện:
Chuẩn bị dung dịch :
- Dung dịch phenol 10 5g Phenol ethanol vđ 50ml - DD acid sulfuric: acid H2SO4đđ 98
- Ethanol nguyên chất .
- DD Glu chuẩn: Lấy 1ml Glutaraldehyde chuẩn 97,5 w v ethanol vđ 50ml. Pha loảng 1 50 cùng dung mơi. DD cĩ nồng độ 390mg l
Chuẩn bị mẫu:
- DD thử: Lấy chính xác 5ml mẫu thử Ethanol vđ 50ml. Pha loảng 1 50 cùng dung mơi. Lấy 1ml 3ml DD phenol 10% + 37ml dd acid sulfuric + H2O vđ 50ml.
- DD đ c: Lấy 1ml DD Glu chuẩn 3ml DD phenol 10 37ml dd acid sulfuric + H2O vđ 50ml. DD đ c cĩ nồng độ 7,8mg l
TN 3.2.2: Pp chuẩn độ
Thực hiện theo PTN Vemedim Tiêu chuẩn cơ sở TC-QA-02-152XK)
Lấy chính xác 800mg mẫu thử hịa tan vào 100ml dd hydro ylamine hydrochloride 7 . ( này trước đư c trung hịa b ng dd NaOH M với ch thị bromophenol blue. Để yên 30 phút, thêm 20ml Ether dầu hỏa cĩ phân đoạn sơi 40 – 600 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
C . Chuẩn độ b ng dd NaOH 1M đến khi màu của lớp nƣớc tƣơng đƣơng với màu của dd hydroxylamine hydrochloride 7% đã trung hịa trƣớc đĩ.
1ml dd NaOH 1M 50,05mg Glutaraldehyde a) Thực hiện:
Chuẩn độ 3 mẫu theo Pp nhƣ trên.
So sánh kết quả định lƣợng Glutaraldehyde trong nguyên liệu thành phẩm b ng 2 Pp: Quang phổ Chuẩn độ
Phần III: Thực Nghiệm Chương 6: Thực Nghiệm và Kết quả
CHƢƠNG 6: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
6.1 THÍ NGHIỆM VỀ XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP QUANG PHỔ
Thực hiện 8 thí nghiệm nhƣ sau:
TN 1.1: Khảo sát độ hấp thu (Abs) theo bƣớc sĩng () của các thành phần tạo phức
a) Mục đích: Xác định sự ảnh hƣởng của các thành phần tạo phức.
b) Thực hiện: Qu t phổ tồn dãy đối với các thành phần tạo phức riêng biệt: Phenol, acid sulfuric, ethanol, Glutaraldehyde.
Chuẩn bị 4 mẫu nhƣ sau:
- Mẫu 1: dung dịch phenol 10 5g Phenol ethanol vđ 50ml - Mẫu 2: dd acid sulfuric: 7ml acid H2SO4đđ pha trong H2O vđ 10ml - Mẫu 3: Ethanol nguyên chất .
- Mẫu 4: dd Glutaraldehyde 0,1 pha trong ethanol Chuẩn bị máy: Set-ref = 480nm, cell so sánh: là cốc rổng.
Qu t phổ từ 190 1100nm gọi tắt: Quét phổ).
c) Kết quả:
Hình 6.1: Sự phụ thuộc của độ hấp thu Abs theo bƣớc sĩng ) (1) Phổ đồ của dd Phenol 10 trong ethanol
(1) (4)
(3) (2)
(4) Phổ đồ của dd Glutaraldehyde 0,1
d) Nhận xét:
Ở vùng bƣớc sĩng từ 400 > 600nm: các thành phần riêng lẻ: Phenol, acid sulfuric, ethanol, Glutaraldehyde thu quang phổ khơng đáng kể.
TN 1.2: Khảo sát Abs theo của mẫu trắng
a) Mục đích: Xác định sự ảnh hƣởng của mẫu trắng.
b) Thực hiện: Qu t phổ tồn dãy đối với hổn hợp các thành phần tạo phức nhƣng khơng cĩ Glutaraldehyde.
Chuẩn bị dung dịch:
- Dung dịch phenol 10 5g Phenol ethanol vđ 50ml - DD acid sulfuric: acid H2SO4đđ 98
- Ethanol nguyên chất .
Chuẩn bị mẫu: 1 mẫu
Lấy 5ml DD phenol 10 10ml H2O dd acid sulfuric vđ 50ml. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});