Bước 1:Chuẩn bị dung dịch đệm và bản gel
Dung dịch đệm thường được sử dụng trong điện di agarose và polyacrylamid là TBE hoặc TAE, trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng TAE và agarose để tạo bản gel.
Bản gel được chuẩn bị bằng dung dịch đệm TAE 1X hòa tan với 1,5 gram agarose đặt trong lò vi sóng ở 1000C trong 5 phút, đổ vào khuôn có các lược được cài sẵn để tạo bản gel với các giếng tra mẫu cần điện di. Khi bản gel đã đông cứng đặt bản gel vào bểđiện di và đổ dung dịch đệm TAE ngập bản gel khoảng 3 – 5mm.
Bước 2:Tra mẫu điện di
Thêm 2µl loading dye vào 8µl sản phẩm RT – PCR, trộn đều hỗn dịch bằng pipet và chuyển vào các giếng trong bản thạch. Điện di đồng thời cả thang chuẩn DNA (marker), thường sử dụng 4 – 6µl DNA Marker.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 29
Bước 3:Chạy điện di
Nguồn điện trong điện di thường sử dụng ở hiệu điện thế 100V cường độ 100mA, thời gian chạy điện di trong 30 phút.
Bước 4: Nhuộm bản gel và đọc kết quả
Kết thúc điện di, bản gel được lấy ra nhuộm Ethidium bromide hoặc SYBR green từ 5 đến 7 phút. Sau khi nhuộm bản gel được chuyển vào máy phát tia UV để quan sát kết quảđiện di. Vị trí các đoạn DNA được phát hiện bằng những vệt sáng tương ứng của thuốc nhuộm, chụp ảnh và lưu kết quả.
2.5.4. Phương pháp quan sát, mô tả.
Lợn được theo dõi hằng ngày: đo thân nhiệt, đo nhịp hô hấp và nhịp tim, quan sát và ghi chép các biểu hiện lâm sàng.
2.5.5. Phương pháp mổ khám kiểm tra bệnh tích đại thể.
Mổ khám theo quy trình của Bộ môn Bệnh lý Thú y để xác định được các biến đổi đại thể của các cơ quan, tổ chức của lợn mắc PRRS. Chúng tôi mổ khám lợn chết vào ngày 12, số lợn thí nghiệm không chết và đối chứng chúng tôi mổ khám vào ngày thứ 21 sau gây nhiễm. Xác lợn bệnh được cố định cẩn thận, tiến hành lấy máu từ vịnh tĩnh mạch cổ, thu dịch swabs (dịch tự nhiên của cơ thể như nhử mắt, nước mũi, dịch ngoáy hầu họng) từ cơ thể nếu có. Bộc lộ xoang ngực, xoang bụng, tách các cơ quan nội tạng khỏi cơ thể quan sát các biến đổi và chụp ảnh. Tiến hành thu mẫu các cơ quan như: phổi, hạch, tim, gan, lách, thận, não để làm tiêu bản vi thể.
2.5.6. Phương pháp làm tiêu bản kiểm tra bệnh tích vi thể
Từ những mẫu bệnh phẩm có các biến đổi đại thể cần tiến hành làm tiêu bản để xác định bệnh tích vi thể chủ yếu của bệnh. Phương pháp làm tiêu bản vi thể theo quy trình tẩm đúc bằng parafin, nhuộm Haematoxylin – Eosin (HE) theo phương pháp của Bộ môn Bệnh lý Thú y, Khoa thú y Học viện Nông Nghiệp Việt Nam. Các bước của quá trình làm tiêu bản vi thể như sau:
- Khử formol:
+ Mục đích để rửa sạch formol.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 30
lấy tổ chức ra khỏi bình formol 10%, cắt thành miếng tổ chức theo chiều dài có độ dài 4 - 5 mm rồi xâu thành một dây sao cho các miếng bệnh phẩm cách nhau 0,5 cm. Trên đầu dây có gắn một mẩu giấy ghi tên bệnh phẩm. Sau đó đem rửa nước chảy nhẹ tối thiểu 24 giờ.
- Khử nước: Lấy bệnh phẩm ra khỏi hệ thống cồn thấm nhẹ trên giấy lọc, rồi cho qua hệ thống gồm 4 lọ cồn:
+ Cồn 900I: 3 giờ. + Cồn 900II: 3 giờ. + Cồn 1000I: 4 giờ. + Cồn 1000II: 12 giờ.