2.1. Đối tượng nghiên cứu
5 lợn 4 tuần tuổi được gây bệnh thực nghiệm bằng chủng virus PRRSV – BN- 10 được cung cấp bởi phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học Thú Y.
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Gây bệnh thực nghiệm cho lợn bằng chủng virus PRRSV-BN-10.
- Xác định các triệu chứng lâm sàng, hàm lượng kháng thể của lợn được gây bệnh thực nghiệm bằng chủng virus PRRSV-BN-10.
- Nghiên cứu bệnh tích đại thể của lợn được gây bệnh thực nghiệm bằng chủng virus PRRSV-BN-10.
- Nghiên cứu bệnh tích vi thể các cơ quan, tổ chức của lợn được gây bệnh thực nghiệm chủng virus PRRSV-BN-10.
2.3. Địa điểm, thời gian nghiên cứu
- Địa điểm: Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học Thú y, phòng thí nghiệm Bộ môn Bệnh lý thú y, phòng nuôi động vật thí nghiệm – Khoa Thú y – Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội.
2.4. Nguyên liệu
2.4.1. Virus
Virus được sử dụng là chủng virus PRRS – BN10, được cung cấp bởi phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học Thú Y, chủng virus này được phân lập từ lợn mắc PRRS, hiệu giá virus là 106TCID50/ml.
2.4.2. Động vật thí nghiệm
Động vật thí nghiệm gồm 5 con lợn 4 tuần tuổi có khối lượng 7 kg/con. Lợn thí nghiệm được chọn là lợn không mắc PRRSV và một số virus khác như Dịch tả lợn, Lở mồm long móng, Circo virus, Rota virus ... và không có kháng thể kháng PRRSV.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 24
2.4.3. Hóa chất
Hoá chất sử dụng làm tiêu bản vi thể, trong nuôi cấy tế bào, nhuộm hóa miễn dịch: Formol 10%, cồn, xylen, parafin, thuốc nhuộm haematoxylin, thuốc nhuộm eosin, môi trường nuôi cấy DMEM, FBS, kháng sinh, DMSO, trypsin, EDTA, PBS, kháng thể kháng PRRS, kháng kháng thể tương ứng chẩn đoán PRRS, muối NaHCO3…
2.4.4. Dụng cụ
- Tủ lạnh, tủấm 370C, tủ sấy, buồng cấy vô trùng.
- Máy đúc tự động, máy cắt Microtom, máy ly tâm lạnh, máy votex, máy PCR, máy chạy điện di, máy chụp ảnh gel.
- Các dụng cụ khác gồm: Lam kính, kính hiển vi, bình nuôi cấy tế bào, ống eppendoft, pipet, găng tay…
2.5. Phương pháp nghiên cứu
2.5.1. Phương pháp gây bệnh thực nghiệm
- Bố trí thí nghiệm: Lô thí nghiệm dùng 3 con, lô đối chứng dùng 2 con. Thí nghiệm: Khu thí nghiệm đảm bảo có độ an toàn sinh học cấp II:
Khu nuôi động vật thí nghiệm được vệ sinh sạch sẽ, thường xuyên phun thuốc sát trùng và các dụng cụ sử dụng luôn đúng quy định vô trùng không để lây nhiễm mầm bệnh từ bên ngoài vào và từ phòng gây nhiễm sang phòng đối chứng.
Quy trình gây nhiễm PRRS cho lợn thực nghiệm bao gồm 5 bước sau: Bước 1: Chọn lợn
Chọn 5 con lợn 1 tháng tuổi có trọng lượng từ 7 kg/con, giống lợn Landrac Lợn được chọn là lợn không mắc PRRSV và một số virus khác như Dịch tả lợn, Lở mồm long móng, Circo virus, Rota virus ... và không có kháng thể kháng PRRSV. Bước 2: Theo dõi lợn trước khi gây nhiễm
Chọn lợn xong cần phải theo dõi lợn 1 thời gian trước khi gây nhiễm, vừa để lợn thích nghi với điều kiện sống mới vừa là để quan sát các biểu hiện bất thường của lợn. Ởđây chúng tôi tiến hành theo dõi 7 ngày trước khi gây nhiễm.
Hằng ngày phải theo dõi nhiệt độ của lợn, kiểm tra nhiệt độ 1 lần trong ngày vào buổi sáng sáng trước khi cho ăn (7- 8 giờ sáng), theo dõi tình trạng sức khỏe,
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 25
tình hình ăn uống, tình trạng lông da cũng như cân nặng của lợn.
Lấy máu kiểm tra xem có kháng thể PRRS trong máu hay không, đồng thời kiểm tra xem lợn có mắc các bệnh truyền nhiễm khác không… Lợn gây nhiễm phải khỏe mạnh, âm tính với PRRS và không mắc các bệnh truyền nhiễm khác như FMD, PCV2, Rota virus… Lợn không có kháng thể kháng PRRSV, âm tính với các bệnh truyền nhiễm thì ta tiến hành gây nhiễm cho lợn.
Bước 3: Gây nhiễm cho lợn
Gây nhiễm cho lợn bằng phương pháp khí dung.
Đưa virus PRRS vào cơ thể lợn qua đường nhỏ mũi với liều 106 TCID50 3ml/con.
Bước 4: Theo dõi lợn sau khi gây nhiễm
Sau khi gây nhiễm PRRSV cần phải theo dõi lợn hằng ngày: + Theo dõi nhiệt độ của lợn mỗi ngày vào buổi sáng và buổi chiều. + Theo dõi tình trạng ăn uống,tình trạng sức khỏe.
+ Cần lấy máu định kì vào các thời điểm 1, 3, 5, 7, 11, 13, 15, 17 và 21 ngày sau gây nhiễm để kiểm tra virus huyết
+ Lấy dịch swab, dịch mắt, phân hằng ngày để kiểm tra nồng độ của virus trong cơ thể lợn.
+ Theo dõi xem gây nhiễm có thành công hay không dựa trên các triệu chứng điển hình của lợn mắc bệnh PRRS và các xét nghiệm máu.
Bước 5: Mổ khám
Khi lợn chết hay khi kết thúc gây nhiễm thì tiến hành mổ khám lợn để quan sát các bệnh tích đại thể và làm tiêu bản kiểm tra bệnh tích vi thể, đồng thời làm tiêu bản nhuộm hóa mô miễn dịch để xem sự phân bố của virus ở các cơ quan trong cơ thể...và đưa ra kết luận vềđộc lực của virus dựa trên khả năng gây bệnh của chúng cho lợn.
2.5.2. Phương pháp ELISA
Các bước thực hiện phản ứng ELISA:
Bước 1: Chuẩn bị các dụng cụ của bộ kit ELISA để ở nhiệt độ phòng. Lấy từ trong túi ra tấm dụng cụ có các giếng chứa kháng thể.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 26
Bước 2: Bổ sung 100µl mẫu đã được pha loãng trong DWP (Deep-well- plate) vào các giếng.
Bước 3: Tiếp tục bổ sung thêm 100µl thuốc thử đối chứng dương và đối chứng âm vào giếng xác định.
Bước 4: Ủ giếng ELISA có phủ kháng nguyên ở nhiệt độ 220C - 270C trong thời gian 30 phút.
Bước 5: Dùng 300ul buffer 1X rửa đĩa ELISA có phủ kháng nguyên, rửa 3 lần bằng mày rửa ELISA tựđộng.
Bước 6: Đổ bỏ dung dịch buffer còn thừa.
Bước 7: Bổ sung 100µl kháng thể HRPO (anti – swine IgG) vào từng giếng, sau đó ủấm trong vòng 30 phút.
Bước 8: Dùng 300ul buffer 1X rửa tấm kháng nguyên 3 lần sau đó đổ bỏ dung dịch còn thừa, giống bước 5 và bước 6.
Bước 9: Bổ sung thêm 100µl TMB substrate. Ủ trong 15 phút ở nhiệt độ phòng nếu phản ứng dương tính tấm phủ kháng nguyên sẽ nổi rõ màu xanh lá cây.
Bước 10: Thêm vào 50µl TMP để dừng phản ứng, lúc này màu sắc sẽ chuyển sang màu vàng.
Bước 11: Đọc kết quả bằng máy đọc ELISA ở bước sóng 450nm. - Kết quả: Độ hấp thụ quang (OD) của mẫu phân tích
Kiểm tra hiệu lực: * Nếu OD ≥ 0,5 dương tính (PC) * Nếu OD ≤ 0,3 âm tính (NC) Tính toán: CPC = OD (PC) – OD (NC) SP = [OD (của mẫu phân tích) – OD (NC)]/CPC + Nếu SP ≥ 0,4 dương tính + Nếu 0,3 ≤ SP ≤ 0,4 nghi ngờ + Nếu SP ≤ 0,3 âm tính
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 27
2.5.3. Phương pháp RT – PCR