Sau quá trình phân lập định tính và nghiên cứu mô học, đề tài tiến hành thí nghiệm cảm nhiễm bằng phương pháp tiêm 2 loài vi khuẩn có tần số bắt gặp và cường độ nhiễm cao gồm: Aeromonas hydrophila và A. salmonicida.
Bảng 3.8. Kết quả cảm nhiễm các chủng vi khuẩn lên cá hồi vân giống khoẻ
Đối chứng Tiêm A. hydrophila Tiêm A. Salmonicida
Biểu hiện của cá ngay sau khi tiêm xong. Cá vẫn bơi lội bình thường. Một vài cá thể bị chuyển màu đen sậm. Cá vẫn bơi lội bình thường. Một vài cá thể bị chuyển màu đen sậm.
Cá vẫn bơi lội bình thường. Một vài cá thể bị chuyển màu hơi đen.
Biểu hiện của cá trong thời gian thí nghiệm.
Những cá thể chuyển màu đen sậm sau 1 ngày thì màu sắc trở lại tự nhiên. Cá khoẻ mạnh bình
Đầu tiên là cá kém ăn, bỏ ăn, bơi chậm chạp trên tầng mặt.
Ở vết tiêm có dấu hiệu xuất huyết, sau đó lan rộng ra và xuất huyết trên
Dấu hiệu đầu tiên là cá kém ăn, bỏ ăn, nổi lờ đờ, bơi sát tầng mặt.
Ở vết tiêm có dấu hiệu xuất huyết dưới da, lan rộng ra nhiều vị trí trên
a b
thường trong suốt thời gian thí nghiệm.
nhiều vị trí khác ở thân, vây kèm theo bong tróc vảy nhẹ.
Gan bầm, xuất huyết, nội tạng cũng xuất huyết, lá lách đen thẫm, xoang bụng tích dịch màu vàng.
thân, vây. Hậu môn cá bị sưng, viêm.
Gan bầm hoặc xuất huyết và nhão, nội tạng cũng xuất huyết, lách đen, xoang bụng tích dịch màu vàng. Thời gian phát bệnh đầu tiên. Cá không có biểu hiện bệnh.
Thời gian phát bệnh đầu tiên ở lô 102, 104 và 106 cfu/ml lần lượt là 72 giờ, 46 giờ và 24 giờ.
Thời gian phát bệnh đầu tiên ở lô 102, 104 và 106 cfu/ml lần lượt là 72 giờ, 48 giờ và 24 giờ. Phân lập lại vi khuẩn ở cá bệnh. Không có cá bị bệnh. Chỉ thu được 1 dạng vi khuẩn đặc thù của A. hydrophila. Chỉ thu được 1 dạng vi khuẩn đặc thù của A. salmonicida. Tỷ lệ chết tích luỹ 0 % Ở lô 102, 104 và 106 cfu/ml lần lượt là 8,9 %, 72,2 % và 100 %. Ở lô 102, 104 và 106 cfu/ml lần lượt là 11,1 %, 71,1 % và 100 %.
Lô thí nghiệm tiêm vi khuẩn Aeromonas hydrophila và A. salmonicida có các dấu hiệu bệnh tương tự nhau và tương tự với dấu hiệu đặc trưng ở cá giống bị bệnh xuất huyết phân lập được hai tác nhân vi khuẩn này. Dấu hiệu đầu tiên sau khi tiêm một ngày là cá kém ăn hoặc bỏ ăn, bơi chậm chạp trên tầng mặt, cá mất màu sắc tự nhiên. Xuất hiện các điểm xuất huyết trên thân cá và đường bên. Đầu tiên là ở vết tiêm sau đó lan rộng thành điểm xuất huyết lớn, kèm theo bong tróc vảy nhẹ. Bệnh gây chết rải rác. Giải phẫu cá thấy gan bầm hoặc xuất huyết, lá lách đen thẫm, xoang bụng có tích dịch màu vàng. Dạ dày và ruột ít hoặc không có thức ăn.
Những dấu hiệu này cũng giống với mô tả của Bùi Quang Tề về bệnh đốm đỏ do vi khuẩn Aeromonas di động gây ra ở Việt Nam [13]. Năm 1989, Karunasagar đề cập đến bệnh loét và nhiễm trùng máu do A.hydrophila cũng có những triệu chứng như trên [66]. Randy (1991) mô tả bệnh nhiễm trùng huyết ở cá với phần nội tạng tích tụ chất lỏng, thiếu máu và hoại tử trong các cơ quan đặc biệt là thận và gan làm tỷ lệ tử vong cao [114].
Bảng 3.9. Tỷ lệ chết tích luỹ trong thí nghiệm cảm nhiễm A.hydrophila Đối chứng Nồng độ 102 Nồng độ 104 Nồng độ 106 Ngày 1 0,0 ± 0,00a 0,0 ± 0,00a 0,0 ± 0,00a 0,0 ± 0,00a Ngày 2 0,0 ± 0,00a 0,0 ± 0,00a 0,0 ± 0,00a 0,0 ± 0,00a Ngày 3 0,0 ± 0,00a 0,0 ± 0,00a 0,0 ± 0,00a 11,1 ± 2,94b Ngày 4 0,0 ± 0,00a 2,2 ± 1,11ab 6,7 ± 1,92b 44,4 ± 2,94c Ngày 5 0,0 ± 0,00a 6,7 ± 0,00a 43,3 ± 3,33b 82,2 ± 2,94c Ngày 6 0,0 ± 0,00a 8,9 ± 1,11b 57,8 ± 2,94c 100 ± 0,00d Ngày 7 0,0 ± 0,00a 8,9 ± 1,11b 72,2 ± 2,22c 100 ± 0,00d
Số liệu trình bày là giá trị trung bình ± sai số chuẩn. Số liệu trong cùng hàng có các chữ cái a, b, c, d khác nhau thể hiện sai khác có ý nghĩa thống kê (p<0,05).
Theo bảng 3.9 cho thấy, cá tiêm ở các nồng độ vi khuẩn 102, 104 và 106 cfu/ml bắt đầu chết vào các ngày lần lượt là ngày thứ 4, thứ 4 và thứ 3. Trong khi lô đối chứng cá được tiêm nước muối sinh lý thì tỷ lệ sống 100 % và khoẻ mạnh bình thường trong suốt thời gian thí nghiệm. Ngoại trừ một vài cá thể bị chuyển màu đen sạm sau khi tiêm thưng sau một ngày nuôi màu sắc cá trở lại tự nhiên. Hiện tượng này có thể do cá bị sốc với các tác động trong quá trình cảm nhiễm như kỹ thuật tiêm, do hạ nhiệt độ để gây tê cá.
Đối với lô thí nghiệm ở nồng độ vi khuẩn 106 cfu/ml, cá chết nhanh chóng trong 4 ngày từ 11,1 % (vào ngày thứ 3) đến 100 % vào ngày thứ 6.
Đối với lô thí nghiệm tiêm ở nồng độ vi khuẩn 104 cfu/ml cá chết rải rác từ ngày thứ 4 cho tới ngày kết thúc thí nghiệm tỷ lệ chết tích lũy là 72,2 %. Đối với lô thí nghiệm tiêm ở nồng độ vi khuẩn 102 cfu/ml cá chết tương đối ít từ ngày thứ 4 là 2,2 % đến ngày thứ 6 là 8,9 %, ngày thứ 7 cá không chết thêm.
Kết quả thống kê ở Bảng 3.9 cho thấy tỷ lệ chết tích lũy giữa các nghiệm thức khác biệt nhau có ý nghĩa về mặt thống kê (p<0,05).
Khi phân lập lại vi khuẩn từ các cá bệnh trong thí nghiệm cảm nhiễm này thì 100 % các mẫu đều phát hiện A. hydrophila.
Đối với thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn Aeromonassalmonicida các hiện tượng sau khi tiêm cũng tương tự như trường hợp cảm nhiễm vi khuẩn A. hydrophila.
Bảng 3.10. Tỷ lệ chết tích luỹ trong thí nghiệm cảm nhiễm A. salmonicida Đối chứng Nồng độ 102 Nồng độ 104 Nồng độ 106 Ngày 1 0,0 ± 0,00a 0,0 ± 0,00a 0,0 ± 0,00a 0,0 ± 0,00a Ngày 2 0,0 ± 0,00a 0,0 ± 0,00a 0,0 ± 0,00a 0,0 ± 0,00a Ngày 3 0,0 ± 0,00a 0,0 ± 0,00a 0,0 ± 0,00a 32,2 ± 4,01b Ngày 4 0,0 ± 0,00a 2,2 ± 1,11a 10,0 ± 0,00b 65,6 ± 4,01c Ngày 5 0,0 ± 0,00a 6,7 ± 3,33b 21,1± 2,94c 100 ± 0,00d Ngày 6 0,0 ± 0,00a 11,1 ± 2,22b 36,7 ± 3,33c 100 ± 0,00d Ngày 7 0,0 ± 0,00a 11,1 ± 2,22b 71,1 ± 2,94c 100 ± 0,00d
Số liệu trình bày là giá trị trung bình ± sai số chuẩn. Số liệu trong cùng hàng có các chữ cái a, b, c, d khác nhau thể hiện sai khác có ý nghĩa thống kê (p<0,05).
Qua bảng 3.10 có thể thấy cá tiêm ở các nồng độ vi khuẩn 102, 104 và 106 cfu/ml bắt đầu chết vào các ngày lần lượt là ngày thứ 4, thứ 4 và thứ 3. Lô đối chứng tỷ lệ sống 100 % và khoẻ mạnh bình thường trong suốt thời gian thí nghiệm. Đối với lô thí nghiệm ở nồng độ vi khuẩn 106 cfu/ml, cá chết nhanh chóng trong 4 ngày từ 32,2 % (vào ngày thứ 3) đến 100 % vào ngày thứ 5. Đối với lô thí nghiệm tiêm ở nồng độ vi khuẩn 104 cfu/ml cá chết rải rác từ ngày thứ 4 (10,00 %) cho tới ngày kết thúc thí nghiệm tỷ lệ chết tích lũy là 71,1 %. Đối với lô thí nghiệm tiêm ở nồng độ vi khuẩn 102 cfu/ml cá chết tương đối ít từ ngày thứ 4 là 2,2 % đến ngày thứ 7 là 11,1 %.
Kết quả thống kê ở Bảng 3.10 cho thấy tỷ lệ chết tích lũy giữa các nghiệm thức khác biệt nhau có ý nghĩa về mặt thống kê (p<0,05).
Khi phân lập lại vi khuẩn từ các cá bệnh trong thí nghiệm cảm nhiễm này thì 100 % các mẫu đều phát hiện A. salmonicida.
Qua kết quả cảm nhiễm vi khuẩn trở lại như trên, có thể khẳng định được vai trò tác nhân chính của hai chủng vi khuẩn Aeromonas hydrophila và A. salmonicida đối với bệnh xuất huyết trên cá hồi vân giai đoạn giống.
Hình 3.12. Cá sau khi cảm nhiễm Aeromonas hydrophila và A. salmonicida 3.4. Kết quả nghiên cứu phòng trị bệnh xuất huyết trên cá hồi vân giống 3.4.1. Kết quả thử kháng sinh đồ
Để có cơ sở cho việc phòng trị bệnh, chúng tôi đã tiến hành thử độ nhạy của các chủng vi khuẩn có tần số bắt gặp cao được phân lập từ cá hồi bị bệnh xuất huyết đối với một số loại kháng sinh thông dụng. Kết quả so sánh đường kính trung bình vòng vô khuẩn với giới hạn vùng ức chế chuẩn của một số loại kháng sinh theo Brock và Madigan (1991) được trình bày ở Bảng 3.11 dưới đây.
Bảng 3.11. Tính nhạy cảm của vi khuẩn đối với một số kháng sinh
Đường kính trung bình vòng vô khuẩn (mm) Loại kháng sinh Độ nhạy
chuẩn (mm) Aeromonas hydrophila Aeromonas salmonicida
Ciprofloxacin (5µg/l) ≥ 19 30 (S) 34 (S)
Erythromycin (15µg/l) ≥ 13 16 (R) 18 (I)
Tetracycline (30µg/l) ≥ 14 15 (I) 17 (R)
Kanamycin (30µg/l) ≥ 13 22 (I) 20 (I)
Streptomycin (10µg/l) ≥ 11 13 (R) 12 (R)
Cefalecin (30µg/l) ≥ 14 17 (I) 15 (R)
Ampicillin (10µg/l) ≥ 11 10 (R) 11 (R)
Hình 3.13. Kết quả thử kháng sinh đồ
Hình a. Aeromonas hydrophila. Hình b. Aeromonas salmonicida.
Qua kết quả thử kháng sinh đồ cho thấy vi khuẩn Aeromonas hydrophila trong nghiên cứu này chỉ còn nhạy cảm với kháng sinh Ciprofloxacin (nhóm fluoroquinolon); nhạy cảm vừa với các kháng sinh Tetracycline, Kanamycin, Cefalecin; đề kháng hoàn toàn với Erythromycin, Streptomycin và Ampicillin. Tương tự A. hydrophila, A. salmonicida cũng nhạy cảm cao với các kháng sinh Ciprofloxacin; nhạy cảm vừa với các kháng sinh Erythromycin, Kanamycin và kháng hoàn toàn với kháng sinh Tetracycline, Streptomycin, Cefalecin và Ampicillin.
Như vậy với kết quả của nghiên cứu này có thể sử dụng Ciprofloxacin để điều trị bệnh xuất huyết trên cá hồi vân giống, tuyệt đối không dùng kháng sinh Ampicillin hoặc Streptomycin để phòng trị bệnh này.
Có nhiều nghiên cứu trên thế giới về mức độ tác dụng của kháng sinh đối với
Aeromonas hydrophila và A. salmonicida. Akinbowale et al. (2007) nghiên cứu 90 chủng
Aeromonas được phân lập từ cá hồi vân ở Australia cho thấy chúng đều nhạy cảm với Cefotaxime, Oxolinic acid, Ciprofloxacin và Gentamicin [17]. Lobova et al. (2015) thông báo 14 chủng vi khuẩn Aeromonas được nghiên cứu là nhạy cảm với kháng sinh Gentamycin, Monomycin và Chloroamphenicol [74]. Krovacek et al. (1989) công bố rằng chủng A. hydrophila nhạy cảm với Chloramphenicol, Neomycin, Sulfamethoxazole, Streptomycin và Trimethoprim/Sulfamethoxazole [71]. Castro-Escarpulli et al. (2003) đã chứng minh rằng tác dụng kháng khuẩn tốt nhất chống lại chủng A. hydrophila là Quinolon thế hệ đầu tiên và Cephalosporin thế hệ thứ hai và thứ ba [34]. Nghiên cứu của Kirkan et al. (2003) trên ba chủng A. salmonicida được phân lập từ gan của 265 mẫu cá
Ci Kn Cef Am Te Strep Er Ci Kn Strep Er Te Cef Am a b
hồi vân ở Thổ Nhĩ Kỳ cho thấy các chủng vi khuẩn đều nhạy cảm với Streptomycine và Ciprofloxacin [68]. Ở Việt Nam, Quách Văn Cao Thi và cộng sự (2014) nghiên cứu tính nhạy cảm với kháng sinh của vi khuẩn A. hydrophila phân lập từ cá tra ở Đồng bằng sông Cửu Long cho kết quả vi khuẩn này nhạy cao với các kháng sinh Ciprofloxacin, Cefotaxim và Doxycyclin [14].
Tuy nhiên, thời gian gần đây, nhiều báo cáo cho thấy các chủng vi khuẩn gây bệnh trên cáđề kháng với nhiều loại kháng sinh (sự đa kháng). Khả năng kháng thuốc của vi khuẩn đặt ra câu hỏi cho con người, liệu nguyên nhân nào đã dẫn đến tình trạng này? Schmidt và cộng sự (2001) cho rằng, ngành nuôi trồng thủy sản có tác động đáng kể đến khả năng kháng thuốc của các loài Aeromonas di động. Sự đa kháng với nhiều loại thuốc kháng sinh khác nhau ngày càng diễn ra ở mức độ cao (48 %). Điều này cho thấy sự lan truyền mạnh mẽ của gen kháng thuốc [104]. Ở Việt Nam, nghiên cứu của Nguyễn Hoàng Nam Kha (2012) cũng ghi nhận 92,4 % vi khuẩn Aeromonas spp. phân lập từ cá tra ở Đồng bằng sông Cửu Long đa kháng thuốc [90]. Nhiều nghiên cứu cho thấy, plasmid được xem là nhân tố quan trọng gây nên hiện tượng đa kháng thuốc ở vi khuẩn do chúng mang các gen mã hóa cho việc kháng lại nhiều nhóm kháng sinh như β-lactam, Macrolide, Trimethoprim/Sulfamethoxazole, Aminoglycosides, Tetracyclin và Fenicol [89, 102]. Theo Thayumanavan và cộng sự (2003), ngoài khả năng kháng được các loại kháng sinh thì sự hiện diện ngày càng tăng của phức chất gây tan máu (gây tiêu hồng cầu) do Aeromonas sản xuất cũng có thể là một mối nguy hiểm tiềm ẩn đối với sức khỏe con người [120].
Aeromonas salmonicida đa kháng với nhiều loại kháng sinh nhóm β-lactam (Pennicillin, Ampicillin, Cloxacillin), nhóm Quinolon (Flumequine, Acid oxolinic, Acid nalidixic), Tetracycline, Chloramphenicol và Novobiocin [54, 68, 136]. Valdes et al.
(2015) đã nghiên cứu trình tự gen của chủng vi khuẩn A. salmonicida CBA100- được cho là đề kháng với nhiều kháng sinh thuộc nhóm Macrolid, β-lactam, Florfenicol và Quinolon phân lập từ cá hồi vân nhiễm bệnh. Kết quả cho thấy có sự tương đồng 1/3 các gen so với chủng A. hydrophila [124]. Sự đề kháng thuốc kháng sinh và trình tự plasmid của 14 chủng vi khuẩn Aeromonas phân lập từ sông Eltsovka-1 (Nga) đã được Lobova et al. (2015) nghiên cứu. Kết quả cho thấy mức đề kháng cao nhất với với Polymyxin B, Lincomycin, Benzilpenicillin, Ampicillin và Carbenicillin. Mức đề kháng thấp đối với
Kanamycin, Streptomycin, Neomycin, Tetracycline và Erythromycin. Đa số các chủng là đa kháng thuốc (chiếm 80,7 %) [74].
Nghiên cứu của Nutcharnart et al. (2012) đã tìm thấy R-plasmid đa kháng Ampicillin, Chloramfenicol, Trimethoprim/Sunfamethoxazol và Tetracyclin của vi khuẩn
Aeromonas hydrophila phân lập trên cá rô phi ở Thái Lan [92]. Vivekanandhan và cộng sự (2002) chứng minh qua nghiên cứu sự kháng thuốc kháng sinh của 319 chủng A. hydrophila phân lập từ cá và tôm cho biết ngoài Chloramphenicol, tất cả các chủng đều kháng Methicillin và Rifampicin, tiếp theo là Bacitracin và Novobiocin [127]. Saavedra
et al. (2004) nghiên cứu khả năng kháng thuốc của các chủng vi khuẩn A. hydrophila
phân lập từ cá hồi vân cho biết, tỉ lệ kháng cao nhất đối với Amoxicillin, Carbenicillin và Ticarcillin [103]. Đặc biệt, theo nghiên cứu của Sevki Kayis et al. (2009) chúng còn kháng với Imipenem, một loại kháng sinh phổ rộng rất tốt, sử dụng cho những trường hợp bị nhiễm khuẩn nặng, cho thấy sự đề kháng có thể đã được chuyển cho quần thể
Aeromonas từ môi trường [107]. Từ Thanh Dung (2010) xác định có 23 % chủng vi khuẩn A. hydrophila biểu hiện đa kháng và hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn ngày càng diễn biến phức tạp hơn, nhất là sự đa kháng ngày càng tăng về số chủng và số lượng thuốc kháng sinh [2]. Gần đây nhất tại Việt Nam, vi khuẩn A. hydrophila phân lập từ cá tra tại Đồng bằng sông Cửu Long trong nghiên cứu của Quách Văn Cao Thi và cộng sự (2014) đề kháng cao với kháng sinh Tetracyclin, Florfenicol và kháng hoàn toàn với kháng sinh nhóm Trimethoprim/Sunfamethoxazol và 3 kháng sinh cùng nhóm β-lactam là Ampicillin, Amoxicillin và Cefalecin [14].
Theo Wen-Chen et al. (1998) vi khuẩn Aeromonas hydrophila là nhóm vi khuẩn kháng thuốc tự nhiên với nhóm β-lactam, chúng tiết ra enzyme β-lactamase phá vỡ vòng β-lactam làm thuốc mất tác dụng [132]. Tuy nhiên, Ciprofloxacin là kháng sinh thuộc nhóm fluoroquinolon gây ức chế enzym DNA girase, ngăn sự sao chép của chromosom làm cho vi khuẩn giảm sinh sản một cách nhanh chóng. Trong khi đó, các nhóm kháng sinh khác (như Betalactam, Aminozid), không ức chế enzym girase nên rất dễ bị vi khuẩn kháng lại. Vì thế, Ciprofloxacin được xem là dùng cho các trường hợp vi khuẩn kháng lại kháng sinh thuộc các nhóm khác (Aminoglycosid, Cephalosporin, Tetracyclin, Penicilin...) và được coi là một trong những thuốc có tác dụng mạnh nhất trong nhóm Fluoroquinolon.
Khả năng kháng thuốc của vi khuẩn Aeromonas hydrophila và A. salmonicida đang diễn biến rất phức tạp và ảnh hưởng đến hiệu quả việc điều trị bệnh vi khuẩn trên cá nói riêng và trong nuôi trồng thủy sản nói chung. Hơn nữa, sự kháng thuốc của vi khuẩn trong thủy sản còn là một mối đe dọa lớn đối với cộng đồng vì chúng có thể truyền gen kháng thuốc sang vi khuẩn gây bệnh ở người thông qua tiếp hợp.
Kết quả thử độ nhạy kháng sinh của các chủng vi khuẩn này là cơ sở cho việc đề ra biện pháp phòng trị đối với bệnh lở loét ở cá hồi vân. Tuy nhiên trong thực tế, một số kháng sinh có hiệu quả trong phòng thí nghiệm lại không ổn định ở bên ngoài môi trường. Do đó, khi sử dụng kháng sinh trị bệnh vi khuẩn cần xét tới các yếu tố như sự hòa