3.2.3.1. Thành phần loài nấm trên cá hồi vân giống bị bệnh xuất huyết
Qua nuôi cấy phân lập xác định được hai giống nấm Saprolegnia và Achlya.
Bảng 3.6. Thành phần loài nấm được phân lập trên cá hồi vân giống bị xuất huyết
Ngành Heterokontophyta
Lớp Nấm Noãn Oomycetes
Bộ Saprolegniales
Họ Saprolegniaceae
Giống Saprolegnia Achlya
Qua kết quả ở Bảng 3.6 có thể thấy thành phần loài nấm bắt gặp trên cá hồi vân giống cũng phù hợp với các nghiên cứu trước đây [4, 7, 20, 62, 113]. Theo các báo cáo bệnh học và tài liệu nghiên cứu trên thế giới thì Saprolegnia được xem là tác nhân cơ hội sau khi cá bị nhiễm ký sinh trùng hoặc cá bị trầy xước trong quá trình vận chuyển. Đây là giống nấm bậc thấp,chủ yếu ký sinh trên các đối tượng thủy sản nước ngọt để gây bệnh, phổ biến nhất là bệnh nấm thủy mi. Chúng có thể làm ung trứng cá, làm cá ngứa ngáy, cà vào các vật thể khác làm tróc vẩy trầy da, tạo điều kiện cho các tác nhân khác xâm nhập, song sự cảm nhiễm nấm sẽ làm gia tăng mức độ trầm trọng của bệnh, tăng tỷ lệ chết. Theo thống kê của Hoshina và cộng sự (1960), nấm Saprolegnia sp. mỗi năm làm thiệt hại tới 50 % sản lượng (tương đương 40 triệu USD) đối với nghề nuôi cá chình tại Nhật Bản [62]. Năm 1994, Beakes và cộng sự cho biết Saprolegnia là tác nhân nguy hiểm đối với nghề nuôi cá hồi ở Tây Bắc Phần Lan [20]. Stueland (2009), đã đưa ra kết quả rằng các chủng nấm Saprolegnia khác nhau thì khác biệt trong khả năng gây bệnh và gây ra tỉ lệ chết ở cá bị nhiễm bệnh. Saprolegnia có thể được phân lập từ trứng và cá hồi vân giống nhiễm bệnh ở Na-uy, Canada, Chile, Scotland. Những triệu chứng của bệnh là trên vây và da của cá xuất hiện những chỗ có màu xám hoặc màu trắng. Khi những chỗ màu xám hoặc trắng này phát triển rộng ra và nhiều giống như bông thì đó là lúc bệnh đang tiến triển mạnh. Sự khác biệt đáng kể trong khả năng gây bệnh giữa các chủng khác nhau của Saprolegnia có thể nhìn thấy thông qua tỉ lệ chết của cá hồi chết thay đổi từ 0 đến 89 % [113]. Đặc điểm hình thái của nấm và khả năng phát triển của chúng liên quan đến khả năng lây nhiễm và gây bệnh ở cá hồi. Giống Saprolegnia có hệ sợi dài mà có tốc độ phát triển cao trong đầu giai đoạn phát triển của chúng thì có khả năng gây bệnh cao nhất. Khả năng này của chúng có thể xuất phát từ việc nấm sợi Saprolegnia chứa bào tử nấm được “trang bị” với nhiều lưỡi móc dài, nên khả năng bào tử dính bám vào cá thể vật chủ phát triển rất cao [113]. Ở Việt Nam Bùi Quang Tề (1997) cho biết, Saprolegnia sp. gây tác hại lớn cho nghề nuôi trồng thủy sản nước ngọt từ giai đoạn sản xuất giống đến giai đoạn nuôi thịt. Các loài cá nước ngọt, baba, ếch đều nhiễm nấm này. Mùa vụ phát bệnh thường là vào mùa mát mẻ, nhiệt độ khoảng từ 18 – 250C là nấm phát triển tốt nhất.
a) Loài Saprolegnea sp.
Hình 3.9. Nấm Saprolegnia sp. phân lập từ cá hồi vân giống ở Lâm Đồng
Nấm Saprolegnia (Hình a và b). Bào tử nấm Saprolegnia (Hình c).
Sợi nấm màu trắng, chiều dài khoảng 3 – 5mm, bề ngang khoảng 25µm, hình ống có phân nhánh, nhưng không có vách ngăn, trên đầu sợi nấm mọc lên những túi bào tử nằm trên 1 cuống dài thẳng đứng, kích thước 35 – 50µm, với các hình thức sinh sản như sinh dưỡng, sinh sản vô tính bằng túi bào tử kín và sinh sản hữu tính.
b) Loài Achlya sp.
Hình 3.10. Nấm Achlya sp. phân lập từ cá hồi vân giống ở Lâm Đồng
Khuẩn lạc Achlya (Hình a). Mẫu tươi Achlya (Hình b). Túi bào tử Achlya (Hình c).
Nấm có dạng sợi, thuộc nhóm nấm bậc thấp, có cấu tạo đa bào nhưng không có vách ngăn. Sợi nấm có chiều dài từ 3 – 5mm, đường kính sợi nấm khoảng 25 – 35µm, có phân nhánh và chia làm hai phần: phần gốc và phần ngọn.
Theo Đỗ Thị Hòa (2004), một số giống bậc thấp trong đó có Achya spp được tìm thấy trên cơ thể cá bị bệnh bị “Hội chứng lở loét” (EUS).
3.2.3.2. Tần suất bắt gặp các loài nấm trên cá hồi vân giống
Bảng 3.7. Tần số bắt gặp các loài nấm trên cá hồi vân giống
Mẫu cá khoẻ (n=17) Mẫu cá bệnh (n=42) Loài nấm TSBG Tỷ lệ (%) TSBG Tỷ lệ (%) Saprolegnia sp. 0/17 0 3/42 7,14 Achlya sp. 0/17 0 4/42 9,52 a b c a b c
Theo kết quả nghiên cứu thì tần số bắt gặp tương đối thấp (7,14 % đối với
Saprolegnia và 9,52 % đối với Achlya). Tỷ lệ này cũng tương tự như trong báo cáo ở cá hồi nuôi thương phẩm tại Lâm Đông của Trần thị Bạch Dương [7]. Thành phần loài cũng phù hợp với các nghiên cứu trước đây [4].
Một số mẫu cá bệnh bị xuất huyết nặng kèm theo bong tróc vảy và lở loét nhẹ nhưng hoàn toàn không có nấm ký sinh nên chưa khẳng định được vai trò của nấm đối với bệnh này ở cá hồi vân giống. Võ Thế Dũng và cộng sự (2011), khi nghiên cứu về các tác nhân có khả năng gây bệnh xuất huyết, lở loét ở cá tầm (nuôi cùng với cá hồi) cũng cho rằng nấm không phải là tác nhân chính gây bệnh xuất huyết, lở loét [5]. Chúng có thể là tác nhân cơ hội, trong quá trình cá phát bệnh, sức khỏe yếu, da bị tổn thương nên chúng đã tấn công vào cá. Vì vậy đề tài không tiến hành cảm nhiễm ngược hai loài nấm này trên cá khoẻ.
3.2.4. Kết quả mô bệnh học cá hồi vân giống bị bệnh xuất huyết
Ở cá hồi vân giống khoẻ mạnh khi cắt mô học và nhuộm H&E có thể thấy cấu trúc mô thận cá khỏe có dạng hình ống, giữa các ống thận liên kết với nhau bằng mô liên kết. Mỗi ống thận gồm nhiều tế bào có hình đa giác xếp dọc theo ống thận và mô có cấu trúc rất rõ ràng. Khi nhuộn H&E nhân sẽ bắt màu xanh của haematocylin và nguyên sinh chất bắt màu hồng của eosin, trong nhân tế bào có hạch nhân nằm một góc sát màng nhân. Đối với mô học cơ cá khỏe mạnh gồm các bó cơ liên kết chặt chẽ với nhau.
Ở cá hồi vân giống bị bệnh xuất huyết, khi thực hiện cắt mô và quan sát dưới kính hiển vi có thể nhận thấy sự hoại tử và xâm nhập của tế bào máu vào các mô rất rõ ràng. Các ống thận ở cá bệnh xuất huyết bị phá hủy không còn dạng hình ống đặc trưng như các khoẻ, ống thận và mô liên kết bị hoại tử. Nhân tế bào có hiện tượng vỡ ra thành nhiều mảnh và bắt màu thuốc nhuộm không rõ ràng. Mô cơ cá bệnh cũng bị hoại tử, không còn liên kết chặt chẽ và có sự xâm lấn của nhiều tế bào máu tại các vùng hoại tử.
Hình 3.11. So sánh mô học cá hồi vân giống khoẻ mạnh và cá bị bệnh xuất huyết
Lát cắt ngang mô thận cá khoẻ (Hình a) và cá bệnh (Hình b). Lát cắt dọc mô cơ cá khoẻ (Hình c) và cá bệnh (Hình d).
3.3. Kết quả nghiên cứu cảm nhiễm ngược
Sau quá trình phân lập định tính và nghiên cứu mô học, đề tài tiến hành thí nghiệm cảm nhiễm bằng phương pháp tiêm 2 loài vi khuẩn có tần số bắt gặp và cường độ nhiễm cao gồm: Aeromonas hydrophila và A. salmonicida.
Bảng 3.8. Kết quả cảm nhiễm các chủng vi khuẩn lên cá hồi vân giống khoẻ
Đối chứng Tiêm A. hydrophila Tiêm A. Salmonicida
Biểu hiện của cá ngay sau khi tiêm xong. Cá vẫn bơi lội bình thường. Một vài cá thể bị chuyển màu đen sậm. Cá vẫn bơi lội bình thường. Một vài cá thể bị chuyển màu đen sậm.
Cá vẫn bơi lội bình thường. Một vài cá thể bị chuyển màu hơi đen.
Biểu hiện của cá trong thời gian thí nghiệm.
Những cá thể chuyển màu đen sậm sau 1 ngày thì màu sắc trở lại tự nhiên. Cá khoẻ mạnh bình
Đầu tiên là cá kém ăn, bỏ ăn, bơi chậm chạp trên tầng mặt.
Ở vết tiêm có dấu hiệu xuất huyết, sau đó lan rộng ra và xuất huyết trên
Dấu hiệu đầu tiên là cá kém ăn, bỏ ăn, nổi lờ đờ, bơi sát tầng mặt.
Ở vết tiêm có dấu hiệu xuất huyết dưới da, lan rộng ra nhiều vị trí trên
a b
thường trong suốt thời gian thí nghiệm.
nhiều vị trí khác ở thân, vây kèm theo bong tróc vảy nhẹ.
Gan bầm, xuất huyết, nội tạng cũng xuất huyết, lá lách đen thẫm, xoang bụng tích dịch màu vàng.
thân, vây. Hậu môn cá bị sưng, viêm.
Gan bầm hoặc xuất huyết và nhão, nội tạng cũng xuất huyết, lách đen, xoang bụng tích dịch màu vàng. Thời gian phát bệnh đầu tiên. Cá không có biểu hiện bệnh.
Thời gian phát bệnh đầu tiên ở lô 102, 104 và 106 cfu/ml lần lượt là 72 giờ, 46 giờ và 24 giờ.
Thời gian phát bệnh đầu tiên ở lô 102, 104 và 106 cfu/ml lần lượt là 72 giờ, 48 giờ và 24 giờ. Phân lập lại vi khuẩn ở cá bệnh. Không có cá bị bệnh. Chỉ thu được 1 dạng vi khuẩn đặc thù của A. hydrophila. Chỉ thu được 1 dạng vi khuẩn đặc thù của A. salmonicida. Tỷ lệ chết tích luỹ 0 % Ở lô 102, 104 và 106 cfu/ml lần lượt là 8,9 %, 72,2 % và 100 %. Ở lô 102, 104 và 106 cfu/ml lần lượt là 11,1 %, 71,1 % và 100 %.
Lô thí nghiệm tiêm vi khuẩn Aeromonas hydrophila và A. salmonicida có các dấu hiệu bệnh tương tự nhau và tương tự với dấu hiệu đặc trưng ở cá giống bị bệnh xuất huyết phân lập được hai tác nhân vi khuẩn này. Dấu hiệu đầu tiên sau khi tiêm một ngày là cá kém ăn hoặc bỏ ăn, bơi chậm chạp trên tầng mặt, cá mất màu sắc tự nhiên. Xuất hiện các điểm xuất huyết trên thân cá và đường bên. Đầu tiên là ở vết tiêm sau đó lan rộng thành điểm xuất huyết lớn, kèm theo bong tróc vảy nhẹ. Bệnh gây chết rải rác. Giải phẫu cá thấy gan bầm hoặc xuất huyết, lá lách đen thẫm, xoang bụng có tích dịch màu vàng. Dạ dày và ruột ít hoặc không có thức ăn.
Những dấu hiệu này cũng giống với mô tả của Bùi Quang Tề về bệnh đốm đỏ do vi khuẩn Aeromonas di động gây ra ở Việt Nam [13]. Năm 1989, Karunasagar đề cập đến bệnh loét và nhiễm trùng máu do A.hydrophila cũng có những triệu chứng như trên [66]. Randy (1991) mô tả bệnh nhiễm trùng huyết ở cá với phần nội tạng tích tụ chất lỏng, thiếu máu và hoại tử trong các cơ quan đặc biệt là thận và gan làm tỷ lệ tử vong cao [114].
Bảng 3.9. Tỷ lệ chết tích luỹ trong thí nghiệm cảm nhiễm A.hydrophila Đối chứng Nồng độ 102 Nồng độ 104 Nồng độ 106 Ngày 1 0,0 ± 0,00a 0,0 ± 0,00a 0,0 ± 0,00a 0,0 ± 0,00a Ngày 2 0,0 ± 0,00a 0,0 ± 0,00a 0,0 ± 0,00a 0,0 ± 0,00a Ngày 3 0,0 ± 0,00a 0,0 ± 0,00a 0,0 ± 0,00a 11,1 ± 2,94b Ngày 4 0,0 ± 0,00a 2,2 ± 1,11ab 6,7 ± 1,92b 44,4 ± 2,94c Ngày 5 0,0 ± 0,00a 6,7 ± 0,00a 43,3 ± 3,33b 82,2 ± 2,94c Ngày 6 0,0 ± 0,00a 8,9 ± 1,11b 57,8 ± 2,94c 100 ± 0,00d Ngày 7 0,0 ± 0,00a 8,9 ± 1,11b 72,2 ± 2,22c 100 ± 0,00d
Số liệu trình bày là giá trị trung bình ± sai số chuẩn. Số liệu trong cùng hàng có các chữ cái a, b, c, d khác nhau thể hiện sai khác có ý nghĩa thống kê (p<0,05).
Theo bảng 3.9 cho thấy, cá tiêm ở các nồng độ vi khuẩn 102, 104 và 106 cfu/ml bắt đầu chết vào các ngày lần lượt là ngày thứ 4, thứ 4 và thứ 3. Trong khi lô đối chứng cá được tiêm nước muối sinh lý thì tỷ lệ sống 100 % và khoẻ mạnh bình thường trong suốt thời gian thí nghiệm. Ngoại trừ một vài cá thể bị chuyển màu đen sạm sau khi tiêm thưng sau một ngày nuôi màu sắc cá trở lại tự nhiên. Hiện tượng này có thể do cá bị sốc với các tác động trong quá trình cảm nhiễm như kỹ thuật tiêm, do hạ nhiệt độ để gây tê cá.
Đối với lô thí nghiệm ở nồng độ vi khuẩn 106 cfu/ml, cá chết nhanh chóng trong 4 ngày từ 11,1 % (vào ngày thứ 3) đến 100 % vào ngày thứ 6.
Đối với lô thí nghiệm tiêm ở nồng độ vi khuẩn 104 cfu/ml cá chết rải rác từ ngày thứ 4 cho tới ngày kết thúc thí nghiệm tỷ lệ chết tích lũy là 72,2 %. Đối với lô thí nghiệm tiêm ở nồng độ vi khuẩn 102 cfu/ml cá chết tương đối ít từ ngày thứ 4 là 2,2 % đến ngày thứ 6 là 8,9 %, ngày thứ 7 cá không chết thêm.
Kết quả thống kê ở Bảng 3.9 cho thấy tỷ lệ chết tích lũy giữa các nghiệm thức khác biệt nhau có ý nghĩa về mặt thống kê (p<0,05).
Khi phân lập lại vi khuẩn từ các cá bệnh trong thí nghiệm cảm nhiễm này thì 100 % các mẫu đều phát hiện A. hydrophila.
Đối với thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn Aeromonassalmonicida các hiện tượng sau khi tiêm cũng tương tự như trường hợp cảm nhiễm vi khuẩn A. hydrophila.
Bảng 3.10. Tỷ lệ chết tích luỹ trong thí nghiệm cảm nhiễm A. salmonicida Đối chứng Nồng độ 102 Nồng độ 104 Nồng độ 106 Ngày 1 0,0 ± 0,00a 0,0 ± 0,00a 0,0 ± 0,00a 0,0 ± 0,00a Ngày 2 0,0 ± 0,00a 0,0 ± 0,00a 0,0 ± 0,00a 0,0 ± 0,00a Ngày 3 0,0 ± 0,00a 0,0 ± 0,00a 0,0 ± 0,00a 32,2 ± 4,01b Ngày 4 0,0 ± 0,00a 2,2 ± 1,11a 10,0 ± 0,00b 65,6 ± 4,01c Ngày 5 0,0 ± 0,00a 6,7 ± 3,33b 21,1± 2,94c 100 ± 0,00d Ngày 6 0,0 ± 0,00a 11,1 ± 2,22b 36,7 ± 3,33c 100 ± 0,00d Ngày 7 0,0 ± 0,00a 11,1 ± 2,22b 71,1 ± 2,94c 100 ± 0,00d
Số liệu trình bày là giá trị trung bình ± sai số chuẩn. Số liệu trong cùng hàng có các chữ cái a, b, c, d khác nhau thể hiện sai khác có ý nghĩa thống kê (p<0,05).
Qua bảng 3.10 có thể thấy cá tiêm ở các nồng độ vi khuẩn 102, 104 và 106 cfu/ml bắt đầu chết vào các ngày lần lượt là ngày thứ 4, thứ 4 và thứ 3. Lô đối chứng tỷ lệ sống 100 % và khoẻ mạnh bình thường trong suốt thời gian thí nghiệm. Đối với lô thí nghiệm ở nồng độ vi khuẩn 106 cfu/ml, cá chết nhanh chóng trong 4 ngày từ 32,2 % (vào ngày thứ 3) đến 100 % vào ngày thứ 5. Đối với lô thí nghiệm tiêm ở nồng độ vi khuẩn 104 cfu/ml cá chết rải rác từ ngày thứ 4 (10,00 %) cho tới ngày kết thúc thí nghiệm tỷ lệ chết tích lũy là 71,1 %. Đối với lô thí nghiệm tiêm ở nồng độ vi khuẩn 102 cfu/ml cá chết tương đối ít từ ngày thứ 4 là 2,2 % đến ngày thứ 7 là 11,1 %.
Kết quả thống kê ở Bảng 3.10 cho thấy tỷ lệ chết tích lũy giữa các nghiệm thức khác biệt nhau có ý nghĩa về mặt thống kê (p<0,05).
Khi phân lập lại vi khuẩn từ các cá bệnh trong thí nghiệm cảm nhiễm này thì 100 % các mẫu đều phát hiện A. salmonicida.
Qua kết quả cảm nhiễm vi khuẩn trở lại như trên, có thể khẳng định được vai trò tác nhân chính của hai chủng vi khuẩn Aeromonas hydrophila và A. salmonicida đối với bệnh xuất huyết trên cá hồi vân giai đoạn giống.
Hình 3.12. Cá sau khi cảm nhiễm Aeromonas hydrophila và A. salmonicida 3.4. Kết quả nghiên cứu phòng trị bệnh xuất huyết trên cá hồi vân giống 3.4.1. Kết quả thử kháng sinh đồ
Để có cơ sở cho việc phòng trị bệnh, chúng tôi đã tiến hành thử độ nhạy của các chủng vi khuẩn có tần số bắt gặp cao được phân lập từ cá hồi bị bệnh xuất huyết đối với một số loại kháng sinh thông dụng. Kết quả so sánh đường kính trung bình vòng vô khuẩn với giới hạn vùng ức chế chuẩn của một số loại kháng sinh theo Brock và Madigan (1991) được trình bày ở Bảng 3.11 dưới đây.
Bảng 3.11. Tính nhạy cảm của vi khuẩn đối với một số kháng sinh
Đường kính trung bình vòng vô khuẩn (mm) Loại kháng sinh Độ nhạy
chuẩn (mm) Aeromonas hydrophila Aeromonas salmonicida
Ciprofloxacin (5µg/l) ≥ 19 30 (S) 34 (S)
Erythromycin (15µg/l) ≥ 13 16 (R) 18 (I)
Tetracycline (30µg/l) ≥ 14 15 (I) 17 (R)
Kanamycin (30µg/l) ≥ 13 22 (I) 20 (I)
Streptomycin (10µg/l) ≥ 11 13 (R) 12 (R)
Cefalecin (30µg/l) ≥ 14 17 (I) 15 (R)
Ampicillin (10µg/l) ≥ 11 10 (R) 11 (R)
Hình 3.13. Kết quả thử kháng sinh đồ