2.2.3.1. Phương pháp nghiên cứu ký sinh trùng
Sử dụng phương pháp nghiên cứu toàn diện KST trên cá của Dolgiel. Mẫu cá sau khi thu được đo chiều dài (mm) và cân trọng lượng (g), sau đó kiểm tra nội và ngoại KST. Những mẫu KST được cố định, làm tiêu bản, bảo quản và tiến hành phân loại.
Hình 2.2. Sơ đồ phân tích ký sinh trùng
• Các bước tiến hành thu mẫu ký sinh trùng.
Quan sát bên ngoài cơ thể cá để phát hiện nhanh một số KST có kích thước lớn như: đỉa cá, giáp xác,... Cạo nhớt da và dàn đều trên kính. Đem quan sát dưới kính hiển vi (4x10, 10x10) để kiểm tra phát hiện KST.
Dùng xilanh hút máu từ tim cá, dàn đều lên lam đem soi tươi hoặc làm tiêu bản nhuộm để quan sát dưới kính hiển vi.
Cắt các vây, xương nắp mang và từng lá mang, bỏ vào các hộp lồng có chứa nước ngọt lọc sạch. Quan sát KST dưới kính soi nổi. Tách KST đưa lên lam kính, đậy lamen và quan sát dưới kính hiển vi (4x10, 10x10).
Mổ cá, quan sát cơ quan nội tạng tìm KST. Tách túi mật, làm tiêu bản dịch mật rồi tiến hành quan sát dưới kính hiển vi. Kiểm tra KST ruột và dạ dày dưới kính soi nổi. Tách KST đưa lên lam và đậy lamen, quan sát dưới kính hiển vi.
Đối với gan, thận, não: đặt lên lam kính, dàn mỏng rồi quan sát dưới kính hiển vi. Chụp ảnh, vẽ, đo kích thước, đếm
Phân loại KST
Kiểm tra KST ngoại ký sinh Giải phẫu kiểm tra KST nội ký sinh
Tiêu bản tươi Tiêu bản cố định
Quan sát KST dưới kính soi nổi, kính hiển vi quang học, mô tả đặc điểm
• Phương pháp làm tiêu bản và phân loại các nhóm ký sinh trùng.
Sán lá đơn chủ:
- Tách chúng ra khỏi ký chủ, cho vào hộp lồng chứa nước ngọt lọc sạch.
- Nghiên cứu trùng sống: Đặt trùng lên lam kính, nhỏ nước cất lên sán rồi quan sát dưới kính hiển vi.
- Làm tiêu bản cố định: (1) Tách sán, đưa lên lam kính, rửa sạch bằng nước cất. (2) Tiến hành cố định và rút nước trong cơ thể sán bằng Glacial acetic acid lần lượt 1 giọt và 1-2 giọt. (3) Gắn bằng bomcanada.
- Phân loại: chủ yếu dựa vào các đặc điểm như hình dạng cơ thể, cấu tạo, kích thước của các cơ quan bám, cơ quan sinh dục.
Động vật nguyên sinh:
Nghiên cứu trùng sống (tiêu bản tươi)
Cạo nhớt hoặc lấy dịch mật, dịch mắt hoặc ép gan, thận, ... Xem dưới kính hiển vi với độ phóng đại 10X hoặc 40X.
Nhuộm tiêu bản cố định: có 2 cách là nhuộm bằng Hematociline và nhuộm bằng Nitrate Bạc (AgNO3) theo phương pháp Klein (Lom và Dykovas, 1992).
• Phương pháp nhuộm
- Nhuộm bằng Hematociline:
Làm trùng no nước: lấy mẫu lần lượt ngâm trong các thang cồn có nồng độ nhỏ dần: 700, 500, 300, 100, để khoảng 10 – 20 phút cho mỗi thang cồn.
Cho mẫu vật vào dung dịch Feric sulfattamoni 2 – 4 %, thời gian ngâm trùng phụ thuộc vào từng KST.
Dùng nước cất rửa 2 lần, mỗi lần 5 phút.
Cho vào dung dịch Hematociline khoảng 2 – 10giờđể trùng bắt màu. Rửa nước trong 30 phút – 1 giờ dưới vòi nước chảy nhẹ.
Nếu quá đậm màu có thể làm nhạt bằng cách rửa qua dung dịch Feric sulfatamoni 2-4 %, thời gian khoảng 6-8 giờ. Khi nào thấy nguyên sinh động vật bắt màu xanh tro hoặc màu xanh tím thì lấy trùng ra. Rửa qua nước chảy nhẹ 1-2 giờ.
Làm mất nước bằng cách cho qua các thang cồn có nồng độ cao dần: 10o, 30o, 50o, 79o, 90o, 100o, cồn xilen (tỷ lệ 1:1). Cuối cùng rửa qua xilen để làm trong sạch trùng.
- Nhuộm bằng Nitrate Bạc (AgNO3):
Lấy lam có trùng xếp một lượt vào chậu thủy tinh (để mặt có trùng lên trên) dùng congtogut nhỏ AgNO3 2 % đều lên khắp mặt lam.
Lấy mẫu ra rửa bằng nước sạch nhiều lần. Tiếp tục ngâm mẫu trong nước ngập sâu 1- 1,5cm, đem phơi nắng khoảng 30- 60 phút tùy theo cường độ ánh sáng mặt trời.
Rửa lại nước cất nhiều lần, dựng nghiêng cho khô.
Quan sát dưới kính hiển vi, gắn tiêu bản bằng nhựa Canada Balsam. Dán nhãn ghi rõ thông tin và bảo quản mẫu.
- Phân loại động vật đơn bào: quan sát các tiêu bản (tươi hoặc cố định) dưới kính hiển vi với độ phóng đại thích hợp. Chụp hình, vẽ, đo, đếm các chỉ tiêu phân loại. Đếm số lượng mỗi loài trên từng thị trường hoặc trên cả lam kính.
+ Phân loại Trichodina: dựa vào số lượng, hình dạng, kích thước răng, đường kính cơ thể và vòng đồng tâm.
+ Phân loại Ceratomyxa: dựa vào hình dạng và kích thước cơ thể (chiều dài, đường kính và tỷ lệ giữa khoảng từ điểm giữa ra đến mút của cánh so với đường ngang thân); hình dạng và vị trí của cực nang.
+ Phân loại Ichthyophthyrius: dựa vào hình dạng, kích thước cơ thể.
- Phân loại sán lá đơn chủ: dựa vào hình dạng cơ thể; cấu tạo, hình dạng, kích thước của các cơ quan bám, cơ quan sinh dục.
2.2.3.2. Phương pháp nghiên cứu vi khuẩn
Dựa theo phương pháp nghiên cứu bệnh vi khuẩn cá và động vật thủy sản của các tác giả sau: Frerichs (1993), Plumb & Bowser (1992), Bùi Quang Tề (1995) và Đỗ Thị Hòa (2005). Tham khảo phương pháp nghiên cứu của Võ Thế Dũng và ctv (2012).
Hình 2.3. Sơ đồ nghiên cứu bệnh do vi khuẩn
• Môi trường nuôi cấy, phân lập và hoá chất
- Môi trường nuôi cấy: Môi trường nuôi cấy TSA không có muối NaCl, NB (Nutrient Broth); Môi trường dùng cho thử các phản ứng sinh hóa: Bộ kít API 20E; O/F cơ bản để kiểm tra khả năng lên men và oxy hóa; Manitol di động khử khả năng di động.
- Hóa chất: Dùng nhuộm Gram vi khuẩn gồm crystal, lugol, cồn acetol, fuchsin; Các loại đĩa giấy kháng sinh dùng trong thử kháng sinh đồ; Nước muối sinh lý, cồn 700.
• Nuôi cấy, phân lập và định danh vi khuẩn
Mẫu bệnh phẩm (gan, thận, lách, vết loét) lấy từ cá bệnh, được rửa lại 2-3 lần bằng nước muối sinh lý 0,85 %, sau đó cho vào ống nghiệm vô trùng và tán nhuyễn bằng đũa thủy tinh. Dùng que cấy đã vô trùng bằng ngọn lửa đèn cồn, để nguội, lấy bệnh phẩm cấy lên đĩa thạch chứa môi trường TSA. Cho đĩa thạch vào tủ ấm 20 – 22 0C và quan sát kết quả sau 24h, yêu cầu trên bề mặt đĩa thạch phải xuất hiện các khuẩn lạc rời nhau. Dựa vào hình dạng, màu sắc và kích thước khuẩn lạc làm cơ sở xác định loài nghiên cứu.
- Nuôi cấy loài thuần:
Chọn những khuẩn lạc riêng rẽ và chiếm ưu thế trên bề mặt các đĩa thạch phân lập để nuôi cấy thuần loài. Dùng que cấy vô trùng để cấy loài thuần chuyển sang đĩa thạch khác,
Đặc điểm, hình thái khuẩn lạc Kết luận Định danh vi khuẩn Nhuộm Gram Thử phản ứng sinh hóa Mẫu cá Thu mẫu bệnh phẩm (Gan, thận, lách, vết loét)
Nuôi cấy thuần Nuôi cấy phân lập
mục đích tạo số lượng lớn vi khuẩn để chuẩn bị cho việc thử các phản ứng sinh hóa làm cơ sở cho việc định danh vi khuẩn hoặc chuyển sang lưu giữ trong trong ống nghiệm chứa môi trường thạch nghiêng TSA có nút đậy tiệt trùng. Không được dùng loài đã cấy chuyển quá 5 lần để hạn chế thoái hóa và giảm độc lực của loài vi khuẩn cần sử dụng.
- Lưu giữ loài thuần: có 2 cách lưu giữ loài:
Môi trường lỏng: dùng Micropipet lấy khoảng 1ml dung dịch môi trường vào ống Ependord chứa môi trường NB (có chứa 20 % Glycerol) rồi dùng que cấy lấy 1 khúm nhỏ khuẩn lạc vi khuẩn đã cấy thuần khuấy đều trong ống. Để trong tủ ấm lắc trong khoảng 100 vòng/phút, sau 24 giờ đem lưu giữ trong tủ đông sâu -800C. Chủng được lưu giữ bằng phương pháp này có thể dùng được đến 2 năm.
Môi trường thạch nghiêng (TSA): dùng que cấy đầu tròn lấy 1 khúm khuẩn lạc từ đĩa thạch đã được cấy thuần ria đều trên mặt thạch nghiêng, để trong tủ ấm 24 giờ cho vi khuẩn mọc đều rồi đem lưu giữ trong tủ lạnh. Bọc các ống nghiệm này trong giấy bạc và túi nhựa vô trùng, bảo quản ở nhiệt độ 5-70C để lưu giống định danh sau. Chủng được lưu giữ bằng phương pháp này có thể dùng được trong vòng 6 tháng.
- Nhuộm Gram để quan sát hình thái vi khuẩn: theo phương pháp của Plumb & Bowser (1983) (bản dịch của Nguyễn Ngọc Nhiên, 1992).
Nhuộm Gram theo các bước sau:
Nhỏ dung dịch tím Crystal lên tiêu bản, để 30-60 giây.
Rửa nước nhanh, vẩy khô nước.
Nhỏ dung dịch Lugol lên tiêu bản và để trong 1 phút.
Rửa nước nhanh, vẩy khô nước.
Nhỏ dung dịch Cồn- Aceton để tẩy màu.
Rửa nhanh nước và vẩy cho khô.
Nhỏ dung dịch Fuchsin lên tiêu bản và để trong 1-2 phút.
Rửa nước, để khô tự nhiên.
Dùng kính hiển vi có vật kính 100x để quan sát tiêu bản: Vi khuẩn có màu xanh tím: Gram dương (+); Vi khuẩn có màu đỏ hồng: Gram âm (-).
- Thử phản ứng sinh hóa để làm cơ sở cho việc định danh vi khuẩn:
Để định danh vi khuẩn còn phải thực hiện một chuỗi các phản ứng sinh hóa thông qua các bộ test kit: Test kit API-20E (Analitical Profile Index).
Test kit API 20E gồm có các ống nghiệm nhỏ (microtube) trong có chứa các chất nền đã khử nước. Trong quá trình ủ, hoạt động của vi khuẩn sẽ làm chuyển màu hoặc làm đục môi trường. Sau 24h đọc các phản ứng đối chiếu theo bảng kết quả để định tên.
Phân loại vi khuẩn dựa vào những đặc điểm sinh lý và kết quả thử phản ứng sinh hoá, Bảng tra kết quả API– 20E và hệ thống phân loại vi khuẩn của Bergey được giới thiệu bởi Holt và CS. (1994), Frerichs và Millar (1993).
Bảng 2.2. Dãy thử phản ứng sinh hóa của Test kit API – 20E
STT Tên phản ứng STT Tên phản ứng
1 OX: Cytocrome oxidase 12 GEL: Gelatinase
2 ONPG: Galactopyranosidase 13 GLU: Lên men/oxi hóa glucose 3 ADH: Argininedihydrolase 14 MAN: Lên men/oxi hóa manitole 4 LDC: Lysine decacboxylase 15 INO: Lên men/oxi hóa inositole 5 ODC: Ornithine decacboxylase 16 SOR: Lên men/oxi hóa Sorbitole
6 CIT: Citrate 17 RHA: Lên men/oxi hóa Rhaminose
7 H2S: H2S production 18 SAC: Lên men/oxi hóa Sucrose
8 URE: Urease 19 MEL: Lên men/oxi hóa Melibiose
9 TDA: Tryptophane deminase 20 AMY: Lên men/oxi hóa Amygdalin 10 IND: Indole production 21 ARA: Lên men/oxi hóa Arabinose
22 NO2: Sinh nitrite 11 VP Acetoin production (Voges
Proskauer) 23 MOB: Khả năng di động
2.2.3.3. Phương pháp nghiên cứu bệnh do nấm
Theo tài liệu của Alexopoulos (1962), Bùi Quang Tề (1995, 1997), Đỗ Thị Hòa và ctv (2003, 2004), Võ Thế Dũng và ctv (2012).
Hình 2.4. Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu bệnh do nấm
• Môi trường nuôi cấy nấm
- Môi trường PDA (Potato Dextrose Agar): 39g/1000 ml.
- Môi trường nghèo dinh dưỡng APW: Sử dụng nước ao đã lọc thô bằng màng lọc, lọc lại qua giấy lọc thấm, đổ vào bình thủy tinh, pha nước cất. Tỷ lệ nước ao và nước cất là 1:2. Sau đó cho vào nồi hấp khử trùng 121 0C trong thời gian 20 phút.
• Phương pháp nuôi cấy và phân loại nấm
Mẫu được đưa về phòng thí nghiệm, tiến hành kiểm tra sự nhiễm nấm bằng phương pháp soi tươi dưới kính hiển vi.
Cách xử lý:
+ Cắt mẫu mang, vây đuôi, nhỏ một giọt nước muối sinh lý lên, đặt lamen trên mẫu rồi soi dưới kính hiển vi quang học để kiểm tra nấm.
+ Cấy mẫu vào môi trường PDA có bổ sung 500µg/ml kháng sinh Peniciline và Streptomycin (để hạn chế sự phát triển của vi khuẩn). Dụng cụ phải được khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn để tránh lẫn tạp trong quá trình nuôi cấy. Nhiệt độ nuôi cấy ở 250C, sau 2-4 ngày quan sát sự phát triển của khuẩn lạc, giống nấm sẽ được thuần loài theo phương pháp nuôi cấy một bào tử.
- Phương pháp nuôi cấy nấm thuần chủng một tế bào:
Thu mẫu bệnh phẩm Soi mẫu tươi
Nuôi cấy thuần bằng phương pháp một bào tử
Quan sát cách sinh sản bào tử
Phân loại Quan sát hình thái bào tử, túi bào tử
Nuôi cấy trên môi trường PDA 15-250C
Đây là phương pháp nuôi cấy tạo ra một loại khuẩn lạc thuần, từ đó có thể quan sát các đặc điểm, hình thái của loài nấm đang nghiên cứu để phân loại.
Từ đĩa môi trường chứa khuẩn lạc, pha loãng thành dung dịch bào tử nấm bằng nước muối sinh lý đến tỷ lệ 3 bào tử/giọt; sau đó, dùng ống hút vô trùng lấy 0,1 ml dung dịch trên chuyển sang đĩa môi trường PDA. Dùng que cấy đã vô trùng trang đều trên môi trường nuôi cấy ở nhiệt độ thích hợp 15 – 220C trong 24h. Chọn những khuẩn lạc rời trên môi trương nuôi cấy để lưu giữ thuần chủng.
- Phương pháp phân loại nấm:
Phân loại nấm: Lấy mẫu sợi nấm soi tươi hoặc nhuộm Xanh Malachite. Quan sát hình dạng, đặc điểm của khuẩn ty, bào tử và dựa vào tài liệu phân loại để xác định.
Phân loại nấm bằng phương pháp của Ainsworth (1973), Frederick và ctv (1969). Phân loại nấm bậc cao áp dụng phương pháp của Booth (1971).
- Phương pháp xác định kích thước hiển vi của nấm:
Tiến hành đo kích thước: đường kính sợi nấm, bào tử, túi bào tử...
Mỗi yếu tố tiến hành đo 30 lần, tính kích thước trung bình của mỗi yếu tố.
2.2.4. Phương pháp mô bệnh học
Sử dụng phương pháp mô bệnh học ở cá được giới thiệu bởi Paul et al. (2000). Cố định mẫu: lấy mẫu thận, cơ cố định bằng dung dịch 10 % formalin trong hệ đệm phosphate (pH = 7.4).
Rút nước và đúc parafin: Mẫu đã cố định được rút nước qua các nồng độ cồn tăng dần (70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 100 %). Sau đó, làm trong mẫu bằng xylene và đúc khuôn paraffin ở nhiệt độ 60 0C. Paraffin sẽ thấm vào trong các khe rỗng mẫu mô nó có tác dụng giữ, bảo vệ các tổ chức mô khi cắt. Giữ khuôn ở bàn lạnh cho đến khi paraffin đông đặc và cứng trở lại. Mẫu được giữ bảo quản trong tủ lạnh, ngăn đá cho đến khi đem ra cắt. Mẫu không bị nứt, không có lỗ, giữa mẫu và khối paraffin trong khuôn đồng nhất, paraffin mịn là đạt yêu cầu.
Cắt mẫu: Sau khi Paraffin đã cứng có thể lấy khuôn đúc ra, lúc này Paraffin thừa và những phần paraffin không cần thiết có thể cắt gọt bỏ đi. Dùng dao cắt mô để cắt gọt mẫu, cắt gọt sao cho vùng mẫu nằm ở giữa khối paraffin, khối paraffin nên được cắt
chỉnh để có mặt cắt là hình chữ nhật hay hình vuông. Mẫu được đưa lên máy cắt mô, chỉnh lát cắt độ dày mức 4 – 5 µm. Mẫu cắt ra được chuyển vào nồi nước ấm 40 0C để làm mẫu phẳng khi đặt trên lam kính.
Ghi ký hiệu mẫu và cho vào bàn sấy khô ở nhiệt độ 68 0C trong vòng 3 – 5 giờ, sau đó mẫu có thể đưa vào nhuộm
Khử parafin và nhuộm tiêu bản bằng Hematocylin trong 5 – 8 phút, rửa qua vòi nước chảy nhẹ, nhuộm Eosin trong 3 – 5 phút, nhúng qua cồn ở các nồng độ 70 %, 95 % và 100 %, tiếp tục cho qua xylen trở lại, để khô, gắn lamen lên tiêu bản bằng bomcanada. Quan sát mẫu bằng kính hiển vi quang học có độ phóng đại 400 lần.
2.2.5. Phương pháp cảm nhiễm ngược để xác định TNGB
Chuẩn bị cá thí nghiệm: Cá thí nghiệm là cá hồi vân giống khoẻ mạnh được nuôi thuần dưỡng 1 tuần trước khi tiến hành thí nghiệm.
Chuẩn bị vi khuẩn và bố trí thí nghiệm: dùng các chủng vi khuẩn có tần số xuất hiện cao trên các mẫu cá bị bệnh xuất huyết. Mỗi chủng vi khuẩn được bố trí 3 thang nồng độ cảm nhiễm lần lượt là 102, 104, 106 cfu/ml bằng cách tiêm dưới da 0,1ml dịch khuẩn/con cá. Nhóm đối chứng tiêm dưới da nước muối sinh lý tiệt trùng 0.85 % 0,1ml/con cá. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, mật độ thả 30 con cá giống/bể.
Chăm sóc và quản lý đàn cá thí nghiệm: thể tích bể 500 lít, chứa 400 lít nước. Nhiệt độ 20 - 210C, pH 8 – 8,5, sục khí 24/24 giờ. Cho cá ăn thức ăn công nghiệp 3 lần/ngày, thay nước 30 % 1lần/ngày, xiphon đáy bể mỗi ngày. Theo dõi tình trạng sức khoẻ cá trong thời gian thí nghiệm (7 ngày).
Hình 2.5. Tiêm cảm nhiễm vi khuẩn vào cá khoẻ
a: Cá trước khi tiêm được gây tê bằng đá lạnh. b: chuyển cá sang thùng nhỏ để chuẩn bị tiêm cảm nhiễm. c: Tiêm cảm nhiễm vi khuẩn. d: Đưa cá đã được tiêm vi khuẩn