Dựa theo phương pháp nghiên cứu bệnh vi khuẩn cá và động vật thủy sản của các tác giả sau: Frerichs (1993), Plumb & Bowser (1992), Bùi Quang Tề (1995) và Đỗ Thị Hòa (2005). Tham khảo phương pháp nghiên cứu của Võ Thế Dũng và ctv (2012).
Hình 2.3. Sơ đồ nghiên cứu bệnh do vi khuẩn
• Môi trường nuôi cấy, phân lập và hoá chất
- Môi trường nuôi cấy: Môi trường nuôi cấy TSA không có muối NaCl, NB (Nutrient Broth); Môi trường dùng cho thử các phản ứng sinh hóa: Bộ kít API 20E; O/F cơ bản để kiểm tra khả năng lên men và oxy hóa; Manitol di động khử khả năng di động.
- Hóa chất: Dùng nhuộm Gram vi khuẩn gồm crystal, lugol, cồn acetol, fuchsin; Các loại đĩa giấy kháng sinh dùng trong thử kháng sinh đồ; Nước muối sinh lý, cồn 700.
• Nuôi cấy, phân lập và định danh vi khuẩn
Mẫu bệnh phẩm (gan, thận, lách, vết loét) lấy từ cá bệnh, được rửa lại 2-3 lần bằng nước muối sinh lý 0,85 %, sau đó cho vào ống nghiệm vô trùng và tán nhuyễn bằng đũa thủy tinh. Dùng que cấy đã vô trùng bằng ngọn lửa đèn cồn, để nguội, lấy bệnh phẩm cấy lên đĩa thạch chứa môi trường TSA. Cho đĩa thạch vào tủ ấm 20 – 22 0C và quan sát kết quả sau 24h, yêu cầu trên bề mặt đĩa thạch phải xuất hiện các khuẩn lạc rời nhau. Dựa vào hình dạng, màu sắc và kích thước khuẩn lạc làm cơ sở xác định loài nghiên cứu.
- Nuôi cấy loài thuần:
Chọn những khuẩn lạc riêng rẽ và chiếm ưu thế trên bề mặt các đĩa thạch phân lập để nuôi cấy thuần loài. Dùng que cấy vô trùng để cấy loài thuần chuyển sang đĩa thạch khác,
Đặc điểm, hình thái khuẩn lạc Kết luận Định danh vi khuẩn Nhuộm Gram Thử phản ứng sinh hóa Mẫu cá Thu mẫu bệnh phẩm (Gan, thận, lách, vết loét)
Nuôi cấy thuần Nuôi cấy phân lập
mục đích tạo số lượng lớn vi khuẩn để chuẩn bị cho việc thử các phản ứng sinh hóa làm cơ sở cho việc định danh vi khuẩn hoặc chuyển sang lưu giữ trong trong ống nghiệm chứa môi trường thạch nghiêng TSA có nút đậy tiệt trùng. Không được dùng loài đã cấy chuyển quá 5 lần để hạn chế thoái hóa và giảm độc lực của loài vi khuẩn cần sử dụng.
- Lưu giữ loài thuần: có 2 cách lưu giữ loài:
Môi trường lỏng: dùng Micropipet lấy khoảng 1ml dung dịch môi trường vào ống Ependord chứa môi trường NB (có chứa 20 % Glycerol) rồi dùng que cấy lấy 1 khúm nhỏ khuẩn lạc vi khuẩn đã cấy thuần khuấy đều trong ống. Để trong tủ ấm lắc trong khoảng 100 vòng/phút, sau 24 giờ đem lưu giữ trong tủ đông sâu -800C. Chủng được lưu giữ bằng phương pháp này có thể dùng được đến 2 năm.
Môi trường thạch nghiêng (TSA): dùng que cấy đầu tròn lấy 1 khúm khuẩn lạc từ đĩa thạch đã được cấy thuần ria đều trên mặt thạch nghiêng, để trong tủ ấm 24 giờ cho vi khuẩn mọc đều rồi đem lưu giữ trong tủ lạnh. Bọc các ống nghiệm này trong giấy bạc và túi nhựa vô trùng, bảo quản ở nhiệt độ 5-70C để lưu giống định danh sau. Chủng được lưu giữ bằng phương pháp này có thể dùng được trong vòng 6 tháng.
- Nhuộm Gram để quan sát hình thái vi khuẩn: theo phương pháp của Plumb & Bowser (1983) (bản dịch của Nguyễn Ngọc Nhiên, 1992).
Nhuộm Gram theo các bước sau:
Nhỏ dung dịch tím Crystal lên tiêu bản, để 30-60 giây.
Rửa nước nhanh, vẩy khô nước.
Nhỏ dung dịch Lugol lên tiêu bản và để trong 1 phút.
Rửa nước nhanh, vẩy khô nước.
Nhỏ dung dịch Cồn- Aceton để tẩy màu.
Rửa nhanh nước và vẩy cho khô.
Nhỏ dung dịch Fuchsin lên tiêu bản và để trong 1-2 phút.
Rửa nước, để khô tự nhiên.
Dùng kính hiển vi có vật kính 100x để quan sát tiêu bản: Vi khuẩn có màu xanh tím: Gram dương (+); Vi khuẩn có màu đỏ hồng: Gram âm (-).
- Thử phản ứng sinh hóa để làm cơ sở cho việc định danh vi khuẩn:
Để định danh vi khuẩn còn phải thực hiện một chuỗi các phản ứng sinh hóa thông qua các bộ test kit: Test kit API-20E (Analitical Profile Index).
Test kit API 20E gồm có các ống nghiệm nhỏ (microtube) trong có chứa các chất nền đã khử nước. Trong quá trình ủ, hoạt động của vi khuẩn sẽ làm chuyển màu hoặc làm đục môi trường. Sau 24h đọc các phản ứng đối chiếu theo bảng kết quả để định tên.
Phân loại vi khuẩn dựa vào những đặc điểm sinh lý và kết quả thử phản ứng sinh hoá, Bảng tra kết quả API– 20E và hệ thống phân loại vi khuẩn của Bergey được giới thiệu bởi Holt và CS. (1994), Frerichs và Millar (1993).
Bảng 2.2. Dãy thử phản ứng sinh hóa của Test kit API – 20E
STT Tên phản ứng STT Tên phản ứng
1 OX: Cytocrome oxidase 12 GEL: Gelatinase
2 ONPG: Galactopyranosidase 13 GLU: Lên men/oxi hóa glucose 3 ADH: Argininedihydrolase 14 MAN: Lên men/oxi hóa manitole 4 LDC: Lysine decacboxylase 15 INO: Lên men/oxi hóa inositole 5 ODC: Ornithine decacboxylase 16 SOR: Lên men/oxi hóa Sorbitole
6 CIT: Citrate 17 RHA: Lên men/oxi hóa Rhaminose
7 H2S: H2S production 18 SAC: Lên men/oxi hóa Sucrose
8 URE: Urease 19 MEL: Lên men/oxi hóa Melibiose
9 TDA: Tryptophane deminase 20 AMY: Lên men/oxi hóa Amygdalin 10 IND: Indole production 21 ARA: Lên men/oxi hóa Arabinose
22 NO2: Sinh nitrite 11 VP Acetoin production (Voges
Proskauer) 23 MOB: Khả năng di động