3.2.2.1. Thành phần loài vi khuẩn trên cá hồi vân giống bị bệnh xuất huyết
Bảng 3.4. Thành phần vi khuẩn được phân lập trên cá hồi vân giống xuất huyết
Ngành Proteobacteria Bacteroidetes
Lớp Gammaproteobacteria Flavobacteria
Bộ Aeromonadales Flavobacteriales
Họ Aeromonadaceae Flavobacteriaceae
Giống Aeromonas Flavobacterium
Loài Aeromonas
hydrophila
Aeromonas
salmonicida Flavobacterium sp. Qua kết quả ở Bảng 3.4 cho thấy thành phần vi khuẩn được phân lập trên cá hồi vân giống xuất huyết gồm có 3 loài vi khuẩn thuộc 2 giống, 2 họ, 2 bộ, 2 lớp và 2 ngành. Trong đó có hai loài vi khuẩn Aeromonas hydrophila và A. salmonicida thuộc họ Aeromonadaceae. Loài còn lại là Flavobacterium sp. thuộc họ Flavobacteriaceae.
Aeromonadaceae là họ vi khuẩn gây bệnh xuất huyết phổ biến ở cá nước ngọt. Vi khuẩn Aeromonas hydrophila cũng đã bắt gặp trên các mẫu cá hồi vân nuôi ở Thổ Nhĩ Kỳ bị bệnh [94]. Emmerich và Weibel (1894) lần đầu tiên nghiên cứu bệnh Furunculosis trên cái hồi nâu ở Đức đã phân lập được A. salmonicida và đây là tác nhân chính gây bệnh. Tác nhân này còn liên quan đến một loạt các bệnh khác trên cá hồi [43].
Flavobacterium là giống vi khuẩn dạng sợi đã được phân lập trên nhiều loài cá khác nhau. F. columnare gây bệnh trắng đuôi ở các loài cá nước ngọt. F. branchiophilum gây
bệnh trên mang (BGD) ở cá hồi. F. psychrophilum gây bệnh vi khuẩn nước lạnh (BCWD) ở cá hồi vân và cá hồi vân [27, 67, 72, 79, 135]. Nhiều nghiên cứu trước đây cho biết khả năng bám chặt là điểm đặc thù của giống Flavobacterium. Có 2 chất giúp vi khuẩn có thể kết dính với bề mặt cơ thể ký chủ đó là glycocaly và galactosamine. Galactosamine giúp bám dính tốt hơn so với các lông tơ (pili) hay các lông tua (fimbriae) của vi khuẩn.
a) Loài Aeromonas hydrophila
Khuẩn lạc Aeromonas hydrophila có màu trắng đục đường kính 1,5-2,5 mm, mép tròn, bề mặt lồi. Vi khuẩn hình que ngắn hai đầu tròn, nhuộm Gram bắt màu hồng của vi khuẩn Gram âm, di động, kích thước 0,5-1 x 1,5-2 µm, oxidase (+), catalase (+).
Hình 3.6. Areomonas hydrophila được phân lập từ cá hồi vân giống bị xuất huyết
Khuẩn lạc A. hydrophila trên môi trường TSA (hình a). Vi khuẩn Gram (-) A. hydrophila được quan sát dưới kính hiển vi vật kính 40X (hình b). Kết quả sinh hóa của vi khuẩn A. hydrophila trên test kit API 20E (hình c).
b) Loài Aeromonas salmonicida
Aeromonas salmonicida là vi khuẩn Gram âm, kỵ khí tuỳ nghi và không di động. Trực khuẩn ngắn tròn hai đầu, bắt màu hồng của thuốc nhuộm fucshin. Kích thước khuẩn lạc 1-2 nm. Phản ứng âm tính khi thủy phân tinh bột, casein, triglyceride, phospholipid. Dương tính với các phản ứng oxidase, gelatin, và catalase. Các chủng điển hình của A. salmonicida tạo sắc tố màu nâu sau 2-3 ngày nuôi cấy trên môi trường TSA, một số chủng thì không tạo sắc tố này.
Aeromonas salmonicida là vi khuẩn khuẩn gây bệnh cho cả cá tự nhiên và cá nuôi, đặc biệt là cá hồi. Nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng của vi khuẩn là 22 - 25 °C. Nhiệt
b a
độ tối đa mà nó có thể sinh trưởng là 34,5 °C.
Hình 3.7. Areomonas salmonicida từ cá hồi vân giống bị xuất huyết
Khuẩn lạc A. salmonicida trên môi trường TSA (hình a). Vi khuẩn Gram (-) A. salmonicida được quan sát dưới kính hiển vi vật kính dầu (hình b). Kết quả sinh hóa của vi khuẩn A. salmonicida trên test kit API 20E (hình c).
a) Loài Flavobacterium sp.
Hình 3.8. Flavobacterium sp. được phân lập từ cá hồi vân giống bị xuất huyết
Khuẩn lạc Flavobacterium sp. phân lập từ cá hồi trên TSA (hình a). Vi khuẩn Flavobacterium sp. được quan sát dưới kính hiển vi vật kính dầu (hình b).
Loài Flavobacterium sp. phân lập được từ cá hồi vân giống bị xuất huyết là vi khuẩn Gram âm, dạng que dài, mảnh, di động được.
3.2.2.2. Tần suất bắt gặp các loài vi khuẩn trên cá hồi vân giống (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 3.5. Tần số bắt gặp các loài vi khuẩn trên cá hồi vân giống
Mẫu cá khỏe (n = 17) Mẫu cá bệnh (n = 42) Tên loài vi khuẩn
TSBG Tỷ lệ ( %) TSBG Tỷ lệ ( %) Aeromonas hydrophyla 2/17 11,76 26/42 61,90 Aeromonas salmonicida 0/17 0 23/42 54,76 Flavobacterium sp. 0/17 0 1/42 2,38 c a b a b
Qua Bảng 3.5 có thể thấy tỷ lệ bắt gặp Aeromonas hydrophila và A. salmonicida
rất cao lần lượt là 61,90 % và 54,76 %. Vi khuẩn Flavobacterium sp. có tỷ lệ bắt gặp rất thấp (2,38 %). Riêng nhóm cá khỏe, cũng đã được tiến hành phân lập vi khuẩn từ gan và thận, nhưng hầu hết các mẫu không có sự hiện diện của vi khuẩn. Ngoại trừ 2/17 mẫu có sự xuất hiện A. hydrophila trong gan, nhưng mức độ cảm nhiễm nhẹ.
Kết quả phân lập trên cho thấy, thành phần giống loài vi khuẩn bắt gặp trên nhóm cá hồi vân giống ít hơn so với trên cá hồi nuôi thương phẩm bị xuất huyết lở loét của nhóm đề tài đã công bố trước đó. Trên cá hồi vân giống bị bệnh xuất huyết chỉ bắt gặp 3 loài vi khuẩn Aeromonas hydrophila, A. salmonicida và Flavobacterium sp. Trong khi đó, trên cá hồi nuôi thương phẩm bị bệnh xuất huyết, lở loét bắt gặp 8 loài vi khuẩn bao gồm Aeromonas hydrophila, Burkholderia cepacia, Edwardsiella tarda, Escherichia vulneri, Escherichia hermanii, Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris, Stenophomonas maltophilia. Trong đó, A. hydrophila là tác nhân chính gây nên bệnh này [4].
Trong số các vi khuẩn được phân lập thì hai loài thuộc họ Aeromonadacea thường gây bệnh xuất huyết phổ biến ở cá nước ngọt. Vi khuẩn A. hydrophila được kết luận là tác nhân chính gây bệnh xuất huyết ở cá hồi vân nuôi tại Thổ Nhĩ kỳ, cá nheo Ictalurus punctatus và lươn đồng Monopterus albus [94, 125, 17]. Theo nghiên cứu của Sevki Kayis và cộng sự (2009), A. hydrophila được xác định là loài thường bắt gặp trên các mẫu cá hồi vân nuôi tại Thổ Nhĩ Kỳ bị bệnh nhiễm trùng máu khi phân tích trên 558 mẫu cá hồi bị bệnh trong hai năm 2006 đến 2008 [107].
3.2.3. Kết quả nghiên cứu nấm trên cá hồi vân giống bị bệnh xuất huyết 3.2.3.1. Thành phần loài nấm trên cá hồi vân giống bị bệnh xuất huyết 3.2.3.1. Thành phần loài nấm trên cá hồi vân giống bị bệnh xuất huyết
Qua nuôi cấy phân lập xác định được hai giống nấm Saprolegnia và Achlya.
Bảng 3.6. Thành phần loài nấm được phân lập trên cá hồi vân giống bị xuất huyết
Ngành Heterokontophyta
Lớp Nấm Noãn Oomycetes
Bộ Saprolegniales
Họ Saprolegniaceae
Giống Saprolegnia Achlya
Qua kết quả ở Bảng 3.6 có thể thấy thành phần loài nấm bắt gặp trên cá hồi vân giống cũng phù hợp với các nghiên cứu trước đây [4, 7, 20, 62, 113]. Theo các báo cáo bệnh học và tài liệu nghiên cứu trên thế giới thì Saprolegnia được xem là tác nhân cơ hội sau khi cá bị nhiễm ký sinh trùng hoặc cá bị trầy xước trong quá trình vận chuyển. Đây là giống nấm bậc thấp,chủ yếu ký sinh trên các đối tượng thủy sản nước ngọt để gây bệnh, phổ biến nhất là bệnh nấm thủy mi. Chúng có thể làm ung trứng cá, làm cá ngứa ngáy, cà vào các vật thể khác làm tróc vẩy trầy da, tạo điều kiện cho các tác nhân khác xâm nhập, song sự cảm nhiễm nấm sẽ làm gia tăng mức độ trầm trọng của bệnh, tăng tỷ lệ chết. Theo thống kê của Hoshina và cộng sự (1960), nấm Saprolegnia sp. mỗi năm làm thiệt hại tới 50 % sản lượng (tương đương 40 triệu USD) đối với nghề nuôi cá chình tại Nhật Bản [62]. Năm 1994, Beakes và cộng sự cho biết Saprolegnia là tác nhân nguy hiểm đối với nghề nuôi cá hồi ở Tây Bắc Phần Lan [20]. Stueland (2009), đã đưa ra kết quả rằng các chủng nấm Saprolegnia khác nhau thì khác biệt trong khả năng gây bệnh và gây ra tỉ lệ chết ở cá bị nhiễm bệnh. Saprolegnia có thể được phân lập từ trứng và cá hồi vân giống nhiễm bệnh ở Na-uy, Canada, Chile, Scotland. Những triệu chứng của bệnh là trên vây và da của cá xuất hiện những chỗ có màu xám hoặc màu trắng. Khi những chỗ màu xám hoặc trắng này phát triển rộng ra và nhiều giống như bông thì đó là lúc bệnh đang tiến triển mạnh. Sự khác biệt đáng kể trong khả năng gây bệnh giữa các chủng khác nhau của Saprolegnia có thể nhìn thấy thông qua tỉ lệ chết của cá hồi chết thay đổi từ 0 đến 89 % [113]. Đặc điểm hình thái của nấm và khả năng phát triển của chúng liên quan đến khả năng lây nhiễm và gây bệnh ở cá hồi. Giống Saprolegnia có hệ sợi dài mà có tốc độ phát triển cao trong đầu giai đoạn phát triển của chúng thì có khả năng gây bệnh cao nhất. Khả năng này của chúng có thể xuất phát từ việc nấm sợi Saprolegnia chứa bào tử nấm được “trang bị” với nhiều lưỡi móc dài, nên khả năng bào tử dính bám vào cá thể vật chủ phát triển rất cao [113]. Ở Việt Nam Bùi Quang Tề (1997) cho biết, Saprolegnia sp. gây tác hại lớn cho nghề nuôi trồng thủy sản nước ngọt từ giai đoạn sản xuất giống đến giai đoạn nuôi thịt. Các loài cá nước ngọt, baba, ếch đều nhiễm nấm này. Mùa vụ phát bệnh thường là vào mùa mát mẻ, nhiệt độ khoảng từ 18 – 250C là nấm phát triển tốt nhất.
a) Loài Saprolegnea sp.
Hình 3.9. Nấm Saprolegnia sp. phân lập từ cá hồi vân giống ở Lâm Đồng
Nấm Saprolegnia (Hình a và b). Bào tử nấm Saprolegnia (Hình c).
Sợi nấm màu trắng, chiều dài khoảng 3 – 5mm, bề ngang khoảng 25µm, hình ống có phân nhánh, nhưng không có vách ngăn, trên đầu sợi nấm mọc lên những túi bào tử nằm trên 1 cuống dài thẳng đứng, kích thước 35 – 50µm, với các hình thức sinh sản như sinh dưỡng, sinh sản vô tính bằng túi bào tử kín và sinh sản hữu tính.
b) Loài Achlya sp.
Hình 3.10. Nấm Achlya sp. phân lập từ cá hồi vân giống ở Lâm Đồng
Khuẩn lạc Achlya (Hình a). Mẫu tươi Achlya (Hình b). Túi bào tử Achlya (Hình c).
Nấm có dạng sợi, thuộc nhóm nấm bậc thấp, có cấu tạo đa bào nhưng không có vách ngăn. Sợi nấm có chiều dài từ 3 – 5mm, đường kính sợi nấm khoảng 25 – 35µm, có phân nhánh và chia làm hai phần: phần gốc và phần ngọn.
Theo Đỗ Thị Hòa (2004), một số giống bậc thấp trong đó có Achya spp được tìm thấy trên cơ thể cá bị bệnh bị “Hội chứng lở loét” (EUS).
3.2.3.2. Tần suất bắt gặp các loài nấm trên cá hồi vân giống
Bảng 3.7. Tần số bắt gặp các loài nấm trên cá hồi vân giống
Mẫu cá khoẻ (n=17) Mẫu cá bệnh (n=42) Loài nấm TSBG Tỷ lệ (%) TSBG Tỷ lệ (%) Saprolegnia sp. 0/17 0 3/42 7,14 Achlya sp. 0/17 0 4/42 9,52 a b c a b c
Theo kết quả nghiên cứu thì tần số bắt gặp tương đối thấp (7,14 % đối với
Saprolegnia và 9,52 % đối với Achlya). Tỷ lệ này cũng tương tự như trong báo cáo ở cá hồi nuôi thương phẩm tại Lâm Đông của Trần thị Bạch Dương [7]. Thành phần loài cũng phù hợp với các nghiên cứu trước đây [4]. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Một số mẫu cá bệnh bị xuất huyết nặng kèm theo bong tróc vảy và lở loét nhẹ nhưng hoàn toàn không có nấm ký sinh nên chưa khẳng định được vai trò của nấm đối với bệnh này ở cá hồi vân giống. Võ Thế Dũng và cộng sự (2011), khi nghiên cứu về các tác nhân có khả năng gây bệnh xuất huyết, lở loét ở cá tầm (nuôi cùng với cá hồi) cũng cho rằng nấm không phải là tác nhân chính gây bệnh xuất huyết, lở loét [5]. Chúng có thể là tác nhân cơ hội, trong quá trình cá phát bệnh, sức khỏe yếu, da bị tổn thương nên chúng đã tấn công vào cá. Vì vậy đề tài không tiến hành cảm nhiễm ngược hai loài nấm này trên cá khoẻ.
3.2.4. Kết quả mô bệnh học cá hồi vân giống bị bệnh xuất huyết
Ở cá hồi vân giống khoẻ mạnh khi cắt mô học và nhuộm H&E có thể thấy cấu trúc mô thận cá khỏe có dạng hình ống, giữa các ống thận liên kết với nhau bằng mô liên kết. Mỗi ống thận gồm nhiều tế bào có hình đa giác xếp dọc theo ống thận và mô có cấu trúc rất rõ ràng. Khi nhuộn H&E nhân sẽ bắt màu xanh của haematocylin và nguyên sinh chất bắt màu hồng của eosin, trong nhân tế bào có hạch nhân nằm một góc sát màng nhân. Đối với mô học cơ cá khỏe mạnh gồm các bó cơ liên kết chặt chẽ với nhau.
Ở cá hồi vân giống bị bệnh xuất huyết, khi thực hiện cắt mô và quan sát dưới kính hiển vi có thể nhận thấy sự hoại tử và xâm nhập của tế bào máu vào các mô rất rõ ràng. Các ống thận ở cá bệnh xuất huyết bị phá hủy không còn dạng hình ống đặc trưng như các khoẻ, ống thận và mô liên kết bị hoại tử. Nhân tế bào có hiện tượng vỡ ra thành nhiều mảnh và bắt màu thuốc nhuộm không rõ ràng. Mô cơ cá bệnh cũng bị hoại tử, không còn liên kết chặt chẽ và có sự xâm lấn của nhiều tế bào máu tại các vùng hoại tử.
Hình 3.11. So sánh mô học cá hồi vân giống khoẻ mạnh và cá bị bệnh xuất huyết
Lát cắt ngang mô thận cá khoẻ (Hình a) và cá bệnh (Hình b). Lát cắt dọc mô cơ cá khoẻ (Hình c) và cá bệnh (Hình d).
3.3. Kết quả nghiên cứu cảm nhiễm ngược
Sau quá trình phân lập định tính và nghiên cứu mô học, đề tài tiến hành thí nghiệm cảm nhiễm bằng phương pháp tiêm 2 loài vi khuẩn có tần số bắt gặp và cường độ nhiễm cao gồm: Aeromonas hydrophila và A. salmonicida.
Bảng 3.8. Kết quả cảm nhiễm các chủng vi khuẩn lên cá hồi vân giống khoẻ
Đối chứng Tiêm A. hydrophila Tiêm A. Salmonicida
Biểu hiện của cá ngay sau khi tiêm xong. Cá vẫn bơi lội bình thường. Một vài cá thể bị chuyển màu đen sậm. Cá vẫn bơi lội bình thường. Một vài cá thể bị chuyển màu đen sậm.
Cá vẫn bơi lội bình thường. Một vài cá thể bị chuyển màu hơi đen.
Biểu hiện của cá trong thời gian thí nghiệm.
Những cá thể chuyển màu đen sậm sau 1 ngày thì màu sắc trở lại tự nhiên. Cá khoẻ mạnh bình
Đầu tiên là cá kém ăn, bỏ ăn, bơi chậm chạp trên tầng mặt.
Ở vết tiêm có dấu hiệu xuất huyết, sau đó lan rộng ra và xuất huyết trên
Dấu hiệu đầu tiên là cá kém ăn, bỏ ăn, nổi lờ đờ, bơi sát tầng mặt.
Ở vết tiêm có dấu hiệu xuất huyết dưới da, lan rộng ra nhiều vị trí trên
a b
thường trong suốt thời gian thí nghiệm.
nhiều vị trí khác ở thân, vây kèm theo bong tróc vảy nhẹ.
Gan bầm, xuất huyết, nội tạng cũng xuất huyết, lá lách đen thẫm, xoang bụng tích dịch màu vàng.
thân, vây. Hậu môn cá bị sưng, viêm.
Gan bầm hoặc xuất huyết và nhão, nội tạng cũng xuất huyết, lách đen, xoang bụng tích dịch màu vàng. Thời gian phát bệnh đầu tiên. Cá không có biểu hiện bệnh.
Thời gian phát bệnh đầu tiên ở lô 102, 104 và 106 cfu/ml lần lượt là 72 giờ, 46 giờ và 24 giờ.
Thời gian phát bệnh đầu tiên ở lô 102, 104 và 106 cfu/ml lần lượt là 72 giờ, 48 giờ và 24 giờ. Phân lập lại vi khuẩn ở cá bệnh. Không có cá bị bệnh. Chỉ thu được 1 dạng vi khuẩn đặc thù của A. hydrophila. Chỉ thu được 1 dạng vi khuẩn đặc thù của A. salmonicida. Tỷ lệ chết tích luỹ 0 % Ở lô 102, 104 và 106 cfu/ml lần lượt là 8,9 %, 72,2 % và 100 %. Ở lô 102, 104 và 106 cfu/ml lần lượt là 11,1 %, 71,1 % và 100 %.
Lô thí nghiệm tiêm vi khuẩn Aeromonas hydrophila và A. salmonicida có các dấu hiệu bệnh tương tự nhau và tương tự với dấu hiệu đặc trưng ở cá giống bị bệnh xuất huyết phân lập được hai tác nhân vi khuẩn này. Dấu hiệu đầu tiên sau khi tiêm một ngày là cá kém ăn hoặc bỏ ăn, bơi chậm chạp trên tầng mặt, cá mất màu sắc tự nhiên. Xuất hiện các điểm xuất huyết trên thân cá và đường bên. Đầu tiên là ở vết tiêm sau đó lan rộng thành điểm xuất huyết lớn, kèm theo bong tróc vảy nhẹ. Bệnh gây chết rải rác. Giải phẫu cá thấy gan bầm hoặc xuất huyết, lá lách đen thẫm, xoang bụng có tích dịch màu vàng. Dạ dày và ruột ít hoặc không có thức ăn.
Những dấu hiệu này cũng giống với mô tả của Bùi Quang Tề về bệnh đốm đỏ do vi khuẩn Aeromonas di động gây ra ở Việt Nam [13]. Năm 1989, Karunasagar đề cập đến bệnh loét và nhiễm trùng máu do A.hydrophila cũng có những triệu chứng như trên [66]. Randy (1991) mô tả bệnh nhiễm trùng huyết ở cá với phần nội tạng tích tụ chất lỏng, thiếu máu và hoại tử trong các cơ quan đặc biệt là thận và gan làm tỷ lệ tử vong cao [114].
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});