Lập kháng sinh đồ theo phương pháp đĩa giấy của Kirby Bauer.
Loài vi khuẩn cần nghiên cứu được nuôi cấy trên đĩa thạch chứa môi trường TSA trước đó 24h. Dùng que cấy vô trùng lấy các khúm khuẩn cho vào ống nghiệm chứa nước muối sinh lý 0,85 % để tạo dịch huyền phù, lắc nhẹ để vi khuẩn phân tán đều trong ống nghiệm đến khi đạt độ đục chuẩn MC Farlan 0,5 tương đương với 108 tế bào/ml.
Lấy 0,5 ml dung dịch huyền phù vi khuẩn láng đều trên bề mặt TSA bằng que cấy trang. Để khô 5-10 phút, đặt lên mặt thạch các đĩa kháng sinh (khoảng 4-6 đĩa kháng sinh/đĩa thạch) sao cho các đĩa kháng sinh cách nhau và cách thành đĩa 1,5-2 cm.
d c
Sau khi cấy, lật ngược hộp lồng đặt trong tủ ấm trong 24h. Độ nhạy của một loại kháng sinh đối với vi khuẩn phụ thuộc vào số đo đường kính vòng vô khuẩn. So sánh số đo này với độ nhạy chuẩn để xác định độ nhạy của kháng sinh.
Đo đường kính vòng vô trùng (mm): Dựa vào đường kính chuẩn của vòng vô trùng theo tài liệu “The Clinical and Laboratory Standards Institute” (CLSI (former NCCLS M31-A2)) của Anonymous (2002) nhằm xác định loại kháng sinh nhạy, trung bình và đề kháng.
2.2.6.2. Phương pháp điều trị bệnh xuất huyết bằng cho ăn kháng sinh
Chuẩn bị cá thí nghiệm: Đàn cá thí nghiệm được gây nhiễm bằng phương pháp cảm nhiễm nhân tạo và có 70 % mang dấu hiệu bệnh (xuất huyết trên thân, bơi lờ đờ).
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm gồm 4 nghiệm thức. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, dùng 30 cá thể/bể. Thể tích bể 500 lít, chứa 400 lít nước. Sau khi trộn kháng sinh vào thức ăn và bao ngoài thức ăn bằng dầu mực. Ở các nghiệm thức sử dụng kháng sinh các nồng độ 0,3 g/kg thức ăn, 0,5 g/kg thức ăn và 0,7 g/kg thức ăn cho ăn liên tục 5 ngày, mỗi ngày một lần. Nghiêm thức đối chứng không dùng kháng sinh. Sau đó, theo dõi cá đến ngày thứ 14 của thí nghiệm.
Chăm sóc và quản lý đàn cá thí nghiệm: Nhiệt độ 20 - 210C, pH 8,0–8,5, sục khí 24/24 giờ. Hàng ngày thay 30 % nước và xiphon đáy. Thức ăn là thức ăn công nghiệp của công ty Inve, cho ăn 3 lần/ngày. Trong quá trình thí nghiệm pH và nhiệt độ được ghi nhận hàng ngày vào 8 giờ sáng và 14 giờ chiều. Số lượng và tỷ lệ cá chết hoặc yếu cũng được ghi nhận hàng ngày. Hiệu quả điều trị bệnh được đánh giá bằng tỷ lệ sống
2.2. Phương pháp xử lý số liệu
Phương pháp thu thập số liệu.
Số liệu thứ cấp: được lấy thông qua các báo cáo có liên quan đến đề tài này.
Số liệu sơ cấp: thời gian, số lượng cá được thu, kích thước, khối lượng cá, các thông số về tỷ lệ cảm nhiễm, cường độ cảm nhiễm..., các thông số môi trường ...
Phương pháp xác định mức độ nhiễm.
• Tỷ lệ nhiễm (TLN):
Số cá bị nhiễm
Tỷ lệ nhiễm (TLN) = x 100 %
• Cường độ nhiễm (CĐN):
Đối với KST có kích thước rất nhỏ không thể đếm hết trên cả lam thì ta đếm trên thị trường kính (TTK) và tính theo công thức sau:
Tổng số trùng trên các thị trường kính
Cường độ nhiễm (CĐN) =
(trùng/TTK) Tổng số thị trường kính kiểm tra có KST
Đối với những KST có kích thước nhỏ như Protozoa, đếm số KST trên từng lam kính và tính theo công thức sau:
Tổng số trùng trên các lam
Cường độ nhiễm (CĐN) =
(trùng/lam) Tổng số các lam kính kiểm tra có KST
Đối với KST có kích thước lớn như giun tròn, giáp xác ta đếm toàn bộ KST trên cơ thể và tính theo công thức sau:
Tổng số trùng trên các cá thể Cường độ nhiễm (CĐN) =
(trùng/cá thể) Tổng số cá thể kiểm tra có KST • Tỷ lệ sống (TLS):
Số cá đưa vào thí nghiệm
Tỷ lệ sống (TLN) = x 100 % Số cá còn sống sau thí nghiệm
Phương pháp phân tích số liệu: tổng hợp, phân tích, so sánh, rút ra nhận xét.
Phương pháp xử lý số liệu: xử lý thông qua phần mềm thống kê excel 2007 và phần mềm SPSS 15.0.
CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Mô tả dấu hiệu bệnh lý ở cá hồi vân giống bị bệnh xuất huyết
Cá hồi vân giống nuôi tại Lâm Đồng đã xuất hiện một số bệnh làm cá chết rải rác. Trong quá trình nghiên cứu và tìm hiểu cho thấy cá thường bị 2 nhóm bệnh chính là bệnh xuất huyết và bệnh mòn vây, cụt đuôi. Tuy nhiên trong giới hạn đề tài chỉ thu mẫu và nghiên cứu nhóm cá bị bệnh xuất huyết.
Bảng 3.1. Các dấu hiệu bệnh lý ở cá hồi vân giống bị bệnh xuất huyết
Dấu hiệu bệnh lý Tần số bắt gặp (n=42) Tỷ lệ ( %)
Cá kém ăn hoặc bỏ ăn 42/42 100
Xuất huyết trên thân, vây và đường bên 34/42 80,95
Da sẫm màu 22/42 52,38
Gan bầm hoặc xuất huyết 23/42 54,76
Gan nhão 15/42 35,71
Nội quan tích dịch 20/42 47,62
Dấu hiệu bên ngoài: Cá bị bệnh có triệu chứng kém ăn đến bỏ ăn, bơi chậm chạp trên tầng mặt. Xuất hiện các điểm xuất huyết trên thân cá, vây hoặc đường bên. Có thể một hoặc nhiều vị trí. Đầu tiên là một hay vài chấm nhỏ, sau đó lan rộng thành điểm xuất huyết lớn, kèm theo bong tróc vảy nhẹ. Cá nhiễm bệnh thường màu da sẫm đen hơn cá khỏe. Bệnh gây chết rải rác.
Hình 3.1. Dấu hiệu bên ngoài của cá hồi vân giống bị xuất huyết
Dấu hiệu bên trong: Giải phẫu những cá bị bệnh xuất huyết điển hình, quan sát bên trong, thường thấy gan bầm, hoặc xuất huyết, nội tạng cũng xuất huyết, lá lách đen thẫm, xoang bụng có tích dịch màu vàng. Nếu cá bị bệnh nặng, gan thường nhão ra. Dạ dày và ruột ít hoặc không có thức ăn. Các cơ quan mềm nhão, hệ thống cơ trong xoang
bụng không chặt chẽ. Tuy nhiên, không phải toàn bộ các dấu hiệu trên đều xuất hiện ở cá nhiễm bệnh. Có dấu hiệu lặp đi lặp lại, có dấu hiệu chỉ xuất hiện vài lần.
Hình 3.2. Giải phẫu cá hồi vân giống cho thấy nội tạng bị xuất huyết, cơ nhão 3.2. Kết quả nghiên cứu các TNGB trên cá hồi vân giống bị bệnh xuất huyết 3.2.1. Kết quả nghiên cứu ký sinh trùng trên cá hồi vân giống bị bệnh xuất huyết
Qua thu mẫu và kiểm tra, thành phần loài và mức độ nhiễm ký sinh trùng trên cá hồi vân giống như sau:
3.2.1.1. Thành phần loài ký sinh trùng trên cá hồi vân giống bị bệnh xuất huyết Bảng 3.2. Thành phần loài ký sinh trùng trên cá hồi vân giống Bảng 3.2. Thành phần loài ký sinh trùng trên cá hồi vân giống
Ngành
Trùng lông Ciliophora Dolflein, 1901 Bào tử sợi
(Myxozoa) Giun dẹp Plathelminthes Schneider, 1878 Lớp Oligohymenophora De Puytorac, 1974 Hymenostomata Delage et Heroward, 1896 Myxosporea Buetschli, 1881 Monogenea (Van beneden, 1858) Bychowsky Bộ Mobilina Kahl, 1933 Tetrahymenita Faure – Fremiet, 1956 Bivalvulida Shulman, 1959 Gyrodactylidea Bychowsky, 1937 Họ Trichodinidae Clau,1874 Ophryoglenidae Kent, 1882 Ceratomixidae Doflein, 1899 Gyrodactylidea Van beneden et Hesse, 1863 Giống Trichodina Ehrenberg, 1830 Ichthyophthirius Fouquet, 1876 Ceratomyxa Theslohan, 1892 Gyrodactylus Nordmann, 1832
Loài Trichodinanigra Ichthyophthirius
multifiliis Ceratomyxa sp. Gyrodactylus
teuchis
Qua kết quả ở Bảng 3.2 cho thấy thành phần kí sinh trùng bao gồm 4 loài thuộc 3 ngành, 4 lớp, 4 bộ, 4 họ, và 4 giống. Ngành trùng lông bao gồm hai giống Trichodina và
Ichthyophthirius. Ngành bào tử sợi gồm 1 giống Ceratomyxa. Giống còn lại là
Như vậy kết quả thành phần loài ký sinh trùng trên cá hồi vân giống tương tự với
báo cáo của FAO năm 2006 gồm loài Ichthyophthirius multifiliis và Gyrodactylus sp.,
giống với kết quả nghiên cứu của Jorgensen và cộng sự năm 2008 phát hiện loài
Ichthyophthirius multifiliis và 2 giống Gyrodactylus và Trichodina, và cũng phù hợp với báo cáo của Bjork và Bartholomew năm 2009 công bố thường xuyên bắt gặp giống
Ceratomyxa ở cá hồi vân [47, 65, 26]. Đây là 4 trong số 6 loài ký sinh trùng thường gây bệnh nghiêm trọng nhất trên cá hồi vân [65, 137].
a) Loài Trichodina nigra
Cơ quan ký sinh là da và mang.
Hình dạng Trichodina nigra nhìn từ mặt bên có dạng hình chuông, mặt bụng giống cái đĩa. Bên trong có một đĩa bám lớn có cấu tạo phức tạp, trên đĩa có một vòng răng gồm 20-22 răng. Răng gồm phần nhánh trong nhọn và ngắn, phần giữa và phần nhánh ngoài ngắn và to phủ gần kín đĩa bám. Nhánh ngoài có hình dạng khác với các loài khác trong giống này.
Đường kính thân 57,6-88 µm, vòng đĩa bám 41,6-54,4 µm. Vòng bám ngoài 28,8- 49,9 µm, vòng móc bám trong 25,6-46,4 µm. Chiều dài nhánh ngoài của răng 4,8-8 µm, nhánh trong 4,8-9,6 µm.
Lúc vận động trùng quay tròn lật qua lật lại như bánh xe. Một phần cơ thể có lông tơ phân bố, lông tơ luôn rung động làm cho cơ thể vận động rất linh hoạt.
b) Loài Ichthyophthirius multifiliis
Cơ quan ký sinh ở da và mang.
Ichthyophthirius multifiliis có hình dạng bầu dục giống quả dưa, đường kính 45,5– 210 µm.
Toàn thân có nhiều lông tơ nhỏ, nhiều đường sọc, vằn dọc. Giữa thân có một hạch lớn hình móng ngựa và một hạch nhỏ hình cầu sát hạch lớn, nhiều không bào và hạt dinh dưỡng (Hình 3.3.a). Phía trước bụng có miệng và tiêm mao miệng.
Hình 3.3. I. multifiliis (hình a) và T. nigra (hình b) ký sinh trên cá hồi vân giống c) Loài Ceratomyxa sp.
Cơ quan ký sinh là mật cá hồi vân.
Cơ thể có hình dạng giống hình trăng non, đường vân ở giữa chia làm 2 cánh đều nhau (dài 7 - 9 µm; rộng 4 - 5 µm mỗi cánh), trên 2 cánh có 2 cực nang hình bầu dục nằm lệch về phía giữa gần với đường vân.
Hình 3.4. Ceratomyxa sp. ký sinh trong mật cá hồi vân giống d) Loài Gyrodactylus teuchis
Hình 3.5. Gyrodactylus teuchis ký sinh ở cá hồi vân giống
Cơ quan ký sinh: ngoại ký sinh ở da, vậy, mang cá.
Cơ thể có chiều dài từ 330 – 410 µm, chiều ngang từ 45 – 55 µm. Khi vận động lộ hai thùy đầu, không có điểm mắt. Phía sau cơ thể là đĩa bám, có hai móc lớn ở giữa đĩa
và 16 móc nhỏ (dài 20 – 30 µm) bằng kitin xếp xung quanh, miệng ở mặt bụng phía trước cơ thể (hình 3.5). Cơ quan tiêu hóa có miệng, hầu, thực quản ngắn, ruột phân nhánh, không có hậu môn. Gyrodactylus teuchis đẻ con.
3.2.1.2. Mức độ nhiễm ký sinh trùng trên cá hồi vân giống
Bảng 3.3. Tỷ lệ và cường độ nhiễm ký sinh trùng trên cá hồi vân giống Cá khoẻ (n=17) Cá bệnh (n=42) Tên loài ký sinh Cơ quan
ký sinh Tỷ lệ nhiễm (%) Cường độ nhiễm Tỷ lệ nhiễm (%) Cường độ nhiễm Nhớt da 11,76 0,6 40,47 4,3 Trichodinanigra Mang 11,76 0,5 35,71 3,1 Nhớt da 5,88 0,2 7,14 4,1 Ichthyophthirius multifiliis Mang 5,88 0,1 4,76 3,3 Gyrodactylus teuchis Da 17,65 2,6 28,57 8,6 Ceratomyxa sp. Mật 5,88 3,5 14,29 6,7
Qua Bảng 3.3 có thể thấy ký sinh trùng chủ yếu có mặt trên những con cá bị bệnh, cá khoẻ có tỷ lệ nhiễm cũng như cường độ nhiễm ký sinh trùng rất thấp. Ở cá bệnh
Trichodinanigra là ký sinh trùng có tỷ lệ nhiễm cao nhất với 40,47 % ở nhớt da, 35,71 % ở nhớt mang và cường độ nhiễm thấp từ 3-4 trùng/lam. Theo Lom và Dykova (1992), có hơn 112 loài Trichodina được phân lập từ cá nước ngọt trên toàn thế giới, trong đó T. nigra là loài thường thấy trên cá hồi vân [75]. Ở Việt Nam, T. nigra thường gây tác hại chủ yếu cho cá hương, cá giống. Loài ký sinh trùng này được bắt gặp ký sinh ở nhiều loài thuỷ sản nước ngọt khác nhau như cá chép, cá trắm cỏ, cá mè trắng, cá mè hoa, cá trê,... Ở nước ta đã bắt gặp loài này ký sinh ở da và mang nhiều loài cá khác nhau ở một số tỉnh miền Trung, Tây Nguyên và đồng bằng Sông Cửu Long. Tuy nhiên các tác giả không cho biết tỷ lệ nhiễm, cường độ nhiễm cũng như khả năng gây bệnh hay tác hại của loài này đối với cá nuôi [12]. Năm 2012, Võ Thế Dũng và cộng sự lần đầu bắt gặp T. nigra trên cá hồi nuôi thương phẩm tại Lâm Đồng, có khả năng gây bệnh nguy hiểm và gây tỷ lệ chết cao [4].
Gyrodactylus teuchis trên các mẫu cá hồi giống bị bệnh xuất huyết có tỷ lệ nhiễm 28,57 % và cường độ nhiễm 8,6 trùng/lam kính. G. teuchis là một trong hơn 400 loài thuộc giống Gyrodactylus được mô tả trên khắp thế giới. Theo FAO, Gyrodactylus
tấn công và gây chết cá. Ở Việt Nam, Đỗ Thị Hòa và cộng tác viên (2004) cho biết
Gyrodactylus sp. đã gây bệnh và làm chết giống cá trê, cá bống tượng, cá rô phi, cá lóc bông [10]. Năm 2011, Võ Thế Dũng và Trần Thị Bạch Dương thông báo bắt gặp
Gyrodactylus sp. ký sinh ở cá hồi vân thương phẩm nuôi tại Lâm Đồng. Không loại trừ khả năng đó chính là G. teuchis. Có thể loài ký sinh trùng này đã theo cá hồi nhập khẩu vào Việt Nam. Tuy nhiên trên thế giới loài này được mô tả từ năm 1999. G. teuchis có cấu tạo hình thái rất giống với G. salaris, nhưng kết quả nghiên cứu bằng sinh học phân tử đã xác định đây là một loài riêng biệt [37]. Năm 2009, Dzika và cộng sự đã phát hiện
G. teuchis ký sinh và gây bệnh nguy hiểm cho cá hồi ở một số nơi như Trung Quốc, Đức [38]. Ở Ba Lan người ta còn phát hiện tỷ lệ nhiễm loài này trên cá hồi vân cao hơn cả các loài sán bắt gặp thường xuyên từ trước đến nay như G. derjavini và G. salaries [115].
Mặc dù vậy người ta cũng chỉ tìm thấy loài này ký sinh trên 3 loài cá hồi là O. mykiss,
Salmo trutta và S. salar [57].
Ichthyophthirius multifiliis cũng xuất hiện trong các mẫu nghiên cứu nhưng với tần số bắt gặp không cao 7,14 % ở nhớt da, 4,76 % ở nhớt mang và cường độ nhiễm thấp từ 3-4 trùng/lam. Loài I. multifiliis được bắt gặp thường xuyên trên các loài thuỷ sản nước ngọt như cá thát lát, cá chép, cá trắm cỏ, cá trôi. Tốc độ phát triển bệnh nhanh, có thể ký sinh trên cả da và mang. Theo báo cáo Meyer (1974) và nhiều tác giả khác, I. multifiliis
chính là tác nhân gây ra bệnh đốm trắng phổ biến trên cá hồi vân, tỉ lệ chết có thể lên đến 100 %, thống kê có hơn 30 % trang trại cá hồi ở nước Anh bị ảnh hưởng bởi I. multifiliis
[82]. Tại Việt Nam, theo Hà Ký (1968) và Nguyễn Thị Muội (1985) đây là một loài ký sinh trùng ngoại ký sinh gây bệnh nguy hiểm và tỷ lệ chết ở cá nhiễm cao. Năm 2007, Hà ký và Bùi Quang Tề cho biết I. multifiliis ký sinh trên da và mang nhiều loài cá, sống ở môi trường nước tĩnh, cỡ cá giống thường mắc bệnh này, cá trê phi với tỷ lệ nhiễm 100 %, cá chim trắng tỷ lệ nhiễm 100 %, cá mè trắng, rô phi,... tỷ lệ nhiễm từ 70 – 100 % , cường độ nhiễm từ 5-7 trùng/lam đã khiến cá chết khi thời tiết mát mẻ, nhiệt độ giảm. Năm 2011, Võ Thế Dũng và Trần Thị Bạch Dương thông báo bắt gặp I. multifiliis và
Gyrodactylus sp. ký sinh ở cá hồi vân thương phẩm nuôi tại Lâm Đồng có khả năng gây bệnh và gây chết cao đối với loài cá này [3].
Loài Ceratomyxa sp. được tìm thấy trong mật của một số cá hồi vân giống bị xuất huyết với tỷ lệ nhiễm thấp 14,29 % và cường độ nhiễm 6,7 trùng/TTK 40. Giống
cá nước ngọt, nước lợ và nước biển. Một số loài trong giống Ceratomyxa cũng thường được tìm thấy ký sinh và gây chết ở cá hồi vân [26]. Ở Việt Nam đã có nhiều công trình công bố bắt gặp Ceratomyxa sp. ký sinh trên cá, gồm cả cá hồi vân [4, 7].
Như vậy có thể thấy thành phần loài ký sinh trùng bắt gặp được tương đối ít. Điều này có thể do môi trường nuôi còn trong sạch, nguồn nước cấp từ các con suối từ núi có độ trong cao, môi trường nuôi chưa bị ô nhiễm, vật chủ lại là giai đoạn cá giống nên ký sinh trùng không có điều kiện để sinh sản phát triển. Chúng góp phần làm cá yếu hơn,
