Nguyên tắc xử lý mẫu: tách chất cần phân tích ergosterol peroxide ra khỏi các tạp chất.
Chuẩn bị mẫu: Tiến hành trên 10 mẫu nấm 1001 đến 1010
Cân 2,0000g mẫu cho vào 20ml methanol, siêu âm 30 phút sau đó ly tâm trong vòng 10 phút ở tốc độ 3500 vòng/phút thu được mẫu lọc qua giấy lọc, tiếp tục lọc qua màng lọc 0.45µm, bơm vào vial và đưa vào máy HPLC đo.
Quá trình chuẩn bị mẫu theo sơ đồ sau:
2.4.2.3. Tối ưu hóa phương pháp
Quá trình tối ưu hóa được thực hiện nhằm mục đích chọn ra phương pháp có tỉ lệ thất thoát hàm lượng ergosterol peroxide trong mẫu là ít nhất, cho hiệu suất cao nhất, kết quả chính xác nhất, cho ra peak đẹp nhất khi phân tích HPLC.
Phương pháp HPLC ergosterol peroxide đã được tối ưu hóa có tính đến các tổn thất trong các bước chiết với các dung môi khác nhau.
Chạy khảo sát chọn các điều kiện : -Thể tích bơm mẫu : 20 μl
-Nhiệt độ cột RP 18 : 350C
-Detector UV (VWD) : λ = 290 nm -Tốc độ dòng : 1,0 ml/min
-Áp suất cột: 77 Bar
-Pha động MeOH : ACN (80 : 20 v/v ) Mẫu nấm Nghiền nhỏ Siêu âm (30 phút) Ly tâm (10 phút) Lọc (giấy lọc) Lọc (màng lọc) Vial HPLC MeOH
Kết quả cho ra peak ở 4,322 min.Peak choãi chân, không nhọn, không cân đối.
+) Thay đổi 1 số điều kiện :
-Pha động MeOH : ACN (85 : 15 v/v ) -Nhiệt độ cột: 300C
Kết quả không có peak.
+) Thay pha động MeOH : ACN (90 : 10 v/v ) -Nhiệt độ cột: 400C
-Kết quả cho peak nhỏ, không rõ. +) Thay pha động MeOH 100% -Nhiệt độ cột: 350C
Kết quả cho peak ở thời gian lưu 4,335 min. Peak đẹp, choãi chân, nhọn, cân đối.
Do đó chọn các điều kiện chạy máy là : -Dung dịch pha động MeOH 100% -Thể tích bơm mẫu :20 μl
-Nhiệt độ cột RP 18 : 350C
-Detector UV (VWD) : λ = 290 nm -Tốc độ dòng : 1,0 ml/min
-Áp suất cột: 77 Bar.