Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao gồm có các bộ phận cơ bản như sau:
Hình 1.14: Sơ đồ hệ thống HPLC Trong đó:
1: Bình chứa pha động. 2: Bộ phận khử khí 3: Bơm cao áp 4: Bộ phận tiêm mẫu 5: Cột sắc ký (pha tĩnh) 6: Đầu dò
7: Hệ thống máy tính có phần mềm ghi nhận tín hiệu, xử lý dữ liệu và điều
khiển hệ thống. 8: In dữ liệu.
1.8.6. Các phương pháp định lượng [7]
Có 4 phương pháp định lượng
Chuẩn bị một dãy dung dịch chuẩn, xây dựng đồ thị chuẩn sự phụ thuộc giữa nồng độ chất chuẩn và diện tích peak thu được, sau đó xử lý thống kê.
Phương trình hồi qui của đường chuẩn theo diện tích peak có dạng: y = mx +b
Trong đó: x: nồng độ, y: diện tích peak s m, b: hằng số.
Đo diện tích peak của chất nghiên cứu trong mẫu (trong cùng điều kiện thực nghiệm) như đường chuẩn, thay y vào phương trình trên ta tìm được CM(X).
1.8.6.2. Phương pháp một mẫu chuẩn
Nếu gọi hX, hch là chiều cao peak ta xác định CM(X) theo phương trình
sau: X ch. X ch h C C h = 1.8.6.3. Phương pháp thêm Do yX =K C. X
Ta thêm vào dung dịch nghiên cứu một lượng dung dịch chuẩn Cch ta được: ( ) X ch X ch y + = K C +C Vậy ta có: X ch.( X ) X ch X y C C y + y = −
1.8.6.4. Phương pháp thêm chuẩn
Thêm vào V ml dung dịch nghiên cứu lần lượt C1, C2,….,Cn dung dịch chuẩn. Sau đó đo các diện tích peak thu được.
Ta có: , ( 1), ( 2),..., ( )
n
X X C X C X C
y y + y + y +
1.8.7. Phương pháp tiến hành sắc ký
1.8.7.1. Chuẩn bị dụng cụ và máy móc
Máy HPLC phải được kiểm chứng theo định kỳ để bảo đảm máy họat động tốt cho kết quả phân tích có độ đúng, độ lặp lại, tuyến tính, tỷ lệ dung môi, tốc độ dòng, năng lượng đèn... đúng theo yêu cầu thông số của máy do nhà sản xuất đặt ra.
Đặc biệt cột sắc ký phải được kiểm tra về số đĩa lý thuyết theo định kỳ hay khi có nghi ngờ về khả năng tách, và rửa đúng qui định sau mỗi lần chạy sắc ký:
Ví dụ: Với sắc ký pha thuận NP-HPLC: rửa bằng MeOH, không rửa bằng nước
Với sắc ký pha đảo RP-HPLC: Khi chạy pha động có các loại muối thì phải rửa nước trước cho sạch muối, sau đó rửa giải.
Tỷ lệ ACN hay MeOH: Nước (50: 50) cho sạch hết các chất còn đọng lại trong cột đồng thời để bảo vệ cột không bị mốc khi để lâu. Tuyệt đối tình trạng chỉ rửa bằng nước 100% sau đó để cột một thời gian không sử dụng chắc chắn cột sẽ bị mốc, hỏng không thể dùng được. Lưu ý nếu rửa cột không tốt thì kết quả chạy sắc ký sẽ không thể đáp ứng được các yêu cầu phân tích.
1.8.7.2. Chuẩn bị dung môi pha động
Các dung môi dùng cho sắc ký là loại tinh khiết HPLC. Các hóa chất dùng phải là loại PA
Đường y = f(CT) yx Cx Cx C TC
Pha dung môi đúng, chính xác theo đúng tỷ lệ đã nêu, để ổn định dung môi đúng thời gian theo chuyên luận đã yêu cầu. Lọc dung môi qua màng lọc 0,2 – 0,45 μm, Siêu âm đuổi bọt khí.
1.8.7.3. Chuẩn bị mẫu đo HPLC
Mẫu thử: Xử lý mẫu thử theo đúng chuyên luận, qui trình theo nguyên tắc:
Dung môi hòa tan hoạt chất phải hòa tan trong pha động, trong nhiều trường hợp dùng dung môi pha động để hòa tan mẫu.
Phải loại bỏ các chất không tan trong pha động hoặc không rửa giải được bằng cách lọc hay chiết…
Phải lọc và ly tâm, lọc mẫu qua màng lọc 0,45 μm.
Nồng độ mẫu ở mức vừa phải, không vượt quá khả năng tách của cột. Có thể gây ra nghẽn cột.
Mẫu chuẩn: Pha dung dịch chuẩn có thành phần giống như mẫu thử trong cùng dung môi, riêng về nồng độ các thành phần giống như mẫu thử là tốt nhất, ngoài ra có thể dùng nồng độ khác nhưng phải nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát của từng thành phần.
1.8.7.4. Cách đo HPLC
Mỗi máy có cách vận hành khác nhau tùy thuộc vào hãng sản xuất, phần mềm sắc ký. Tuy nhiên cách vận hành luôn phải theo nguyên tắc sau:
Chạy máy với dung môi pha động để đuổi hết bọt khí có trong hệ thống ống dẫn trước khi cho vào cột.
Đặt đầy đủ các điều kiện sắc ký như: + Cấu hình máy.
+ Tỷ lệ các dung môi pha động.
+ Bước sóng, thành phần mẫu, các thông số của quá trình phân tích yêu cầu.
Chương 2
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 2.1. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất
2.1.1. Thiết bị
-Cân phân tích có độ chính xác ±0,1mg. -Cân kỹ thuật độ chính xác ±0,1g
-Bể siêu âm
-Máy ly tâm (vortex)
-Thiết bị lọc : Màng lọc 13mm, 0,45 µm (PTFE)
-Hệ thống máy HPLC Agilent 1100 kết nối với đầu dò UV có thể điều chỉnh bước sóng 290nm.
-Cột sắc ký pha đảo RP18 (150 x 4,6mm; 5μm) và cột bảo vệ.
2.1.2. Dụng cụ
Dụng cụ thủy tinh các loại : -Bình định mức 100 ml , 10 ml. -Pipet : 25 ml, 10 ml…,
-Phễu thủy tinh
-Bình tam giác 50 ml , 25ml…
2.1.3. Hóa chất
-Nước cất 2 lần khử ion -Methanol
-Acetonitrile
(Loại dùng cho HPLC, tinh khiết p.a)
2.2. Phương pháp lấy và xử lý sơ bộ mẫu phân tích
Hàm lượng ergosterol và ergosterol peroxide được xác định từ các mẫu nấm (Linh chi 1001, 1002, 1003, 1004, 1005,1006, 1007, 1008, 1009, 1010) được lấy từ Phù Mát, Nghệ An vào tháng 3/2013.
Nấm (1,5 kg mỗi loại) được cắt thành 1 cm3 hình khối, hỗn hợp, được đựng vào túi plastic kín và bảo quản ở nhiệt độ thường .
Mẫu sau khi lấy về được xử lý tiếp bằng phương pháp chiết chọn lọc với các dung môi thích hợp để thu được chất phân tích.
Sau đây là hình ảnh các mẫu nấm:
Hình 2.1: Mẫu nấm 1001(Perenniporia martius) Hình 2.2: Mẫu nấm 1002 (Fomitopsis dochmius)
Hình 2.3: Mẫu nấm 1003 (Phellinus igniarius) Hình 2.4: Mẫu nấm 1004 (Ganoderma rotumdatum)
Hình 2.7: Mẫu nấm 1007 (Ganoderma philippii) Hình 2.8: Mẫu nấm 1008 (Ganoderma multiplicatum)
Hình 2.9: Mẫu nấm 1009 (Ganoderma lucidum) Hình 2.10: Mẫu nấm 1010 (Trametes gibbosa)
2.3. Phương pháp phân tích
Để phân tích định lượng ergosterol và ergosterol peroxide trong mẫu thử dùng phương pháp: Sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC.
2.4. Kỹ thuật thực nghiệm
2.4.1. Phân tích ergosterol
2.4.1.1. Chuẩn bị hóa chất phân tích
Ergosterol tiêu chuẩn (độ tinh khiết > 90%)
- Pha dung dịch MeOH : ACN = 85:15 (v/v) trong bình định mức 100 ml. - Cân 10 mg chất chuẩn cho vào bình định mức 10 ml ; định mức đến vạch bằng dung dịch pha động ta được chuẩn gốc 1000 ppm.
- Đánh siêu âm để chất chuẩn hòa tan hoàn toàn vào dung môi sau đó lọc qua màng lọc rồi pha loãng ta được các dung dịch chuẩn trung gian.
Pha dãy chuẩn : pha loãng nồng độ 50 ml, 100 ml bằng hỗn hợp dung dịch pha động.
• Lấy 1ml dung dịch chuẩn gốc 1000 ppm cho vào bình định mức 10 ml, định mức đến vạch bằng 9ml dung dịch MeOH : ACN = 85:15 (v/v) ta được chuẩn 100 ppm.
• Lấy 5 ml dung dịch chuẩn trung gian 100 ppm vào bình định mức 10 ml, định mức đến vạch bằng dung dịch MeOH : ACN = 85:15 (v/v) ta được chuẩn 50 ppm.
Dung dịch chuẩn gốc sau khi pha loãng tiêu chuẩn, có thể lưu giữ tại 4°C trong vòng một tuần.
2.4.1.2. Xây dựng đường chuẩn
Để xác định được hàm lượng của ergosterol trong mẫu người ta dựa vào mối quan hệ giữa nồng độ và diện tích peak trên đường chuẩn đã được thiết lập sẵn. Dựa vào đường chuẩn và diện tích peak đo được ta sẽ tính được hàm lượng ergosterol.
Chuẩn bị: Để xây dựng đường chuẩn ta chuẩn bị một dãy dung dịch chuẩn đã biết chính xác nồng độ. Cụ thể ở đây chúng tôi chuẩn bị 3 mẫu có nồng độ lần lượt là: 50ppm; 100ppm; 1000ppm. Bơm vào máy HPLC đã được cài đăt chương trình.
2.4.1.3. Kỹ thuật chuẩn bị mẫu
Để xác định hàm lượng ergosterol trong mẫu nấm cần phải xử lý mẫu và bơm vào máy HPLC.
- Nguyên tắc xử lý mẫu:
Tách chất phân tích ergosterol khỏi các tạp chất vào dung môi pha động. Lọc qua giấy lọc và lọc qua màng lọc 13mm, 0,45μm.
- Cách tiến hành:
• Cân các mẫu đã được xay nhỏ (khoảng 2,0000g; với độ ẩm 24%). Mẫu 1 (ký hiệu mẫu nấm 1001) : 2,0004 g
Mẫu 3 (ký hiệu mẫu nấm 1003) : 2,0006 g Mẫu 4 (ký hiệu mẫu nấm 1004) : 2,0003 g Mẫu 5 (ký hiệu mẫu nấm 1005) : 2,0006 g Mẫu 6 (ký hiệu mẫu nấm 1006) : 2,0002 g Mẫu 7 (ký hiệu mẫu nấm 1007) : 2,0003 g Mẫu 8 (ký hiệu mẫu nấm 1008) : 2,0002 g Mẫu 9 (ký hiệu mẫu nấm 1009) : 2,0003 g Mẫu 10 (ký hiệu mẫu nấm 1010) : 2,0004 g
• Hòa tan mẫu với 20 ml dung dịch MeOH : ACN = 85:15 (v/v). • Lắc đều, siêu âm trong 30 phút.
• Ly tâm mẫu đã siêu âm xong trong 10 phút, tốc độ 3500 vòng/phút. • Mẫu sau ly tâm được lọc qua giấy lọc, sau đó lọc qua màng lọc rồi cho vào các vial khác nhau.Ghi nhãn cho từng mẫu ở từng vial rồi đưa đi phân tích HPLC.
• Các mẫu được lưu trữ (4°C trong bóng tối) cho đến khi phân tích HPLC.
2.4.1.4. Tối ưu hóa phương pháp
Quá trình tối ưu hóa được thực hiện nhằm mục đích chọn ra phương pháp có tỉ lệ thất thoát hàm lượng ergostterol trong mẫu là ít nhất, cho hiệu suất cao nhất, kết quả chính xác nhất, cho ra peak đẹp nhất khi phân tích HPLC.
Phương pháp HPLC ergosterol đã được tối ưu hóa có tính đến các tổn thất trong các bước chiết với các dung môi khác nhau.
Chạy khảo sát chọn các điều kiện : -Thể tích bơm mẫu : 20 μl
-Nhiệt độ cột RP 18 : 300C
-Detector UV (VWD) : λ = 290 nm -Tốc độ dòng : 1,0 ml/min
-Pha động MeOH : ACN (80 : 20 v/v )
Kết quả cho ra peak ở 16,291 min.Peak choãi chân, không nhọn, không cân đối.
+) Thay đổi 1 số điều kiện :
-Pha động MeOH : ACN (85 : 15 v/v ) -Nhiệt độ cột: 400C
Kết quả không có peak.
+) Thay pha động MeOH : ACN (75 : 25 v/v ) -Nhiệt độ cột: 300C
-Kết quả cho peak nhỏ, không rõ.
+) Thay pha động MeOH : ACN (85 : 15 v/v ) -Nhiệt độ cột: 300C
Kết quả cho peak ở thời gian lưu 16.295 min. Peak đẹp, choãi chân, nhọn, cân đối.
Do đó chọn các điều kiện chạy máy là :
-Dung dịch pha động MeOH : ACN (85 : 15 v/v ) -Thể tích bơm mẫu :20 μl
-Nhiệt độ cột RP 18 : 300C
-Detector UV (VWD) : λ = 290 nm -Tốc độ dòng : 1,0 ml/min
-Áp suất cột: 71 Bar.
2.4.1.5. Tiến hành phân tích trên máy HPLC/UV
-Cột sắc ký : Cột pha đảo RP 18 (150 x 4,6 mm, 5 μm) -Nhiệt độ cột : Nhiệt độ phòng
-Pha động : MeOH : ACN (85 : 15 v/v ). Đánh siêu âm đến hết bọt trước khi sử dụng -Thể tích tiêm mẫu : 20μl.
-Tốc độ dòng : 1,0 ml/phút
-Áp suất 68-71 bar.
-Thời gian lưu là 16,3 ± 0,2 min.