Trong sắc ký phân bố nói chung, pha tĩnh là những hợp chất hữu cơ được gắn lên chất mang rắn silica hoặc cấu thành từ silica theo hai kiểu:
Pha tĩnh được giữ lại trên chất mang rắn bằng cơ chế hấp phụ vật lý → sắc ký lỏng-lỏng (liquid-liquid chromatography). Pha tĩnh liên kết hóa học với chất nền → sắc ký pha liên kết (bonded phase chromatography).
Trong quá trình sử dụng, người ta nhận thấy sắc ký pha liên kết có nhiều ưu điểm hơn sắc ký pha lỏng - lỏng vì một số nguyên nhân sau:
Pha tĩnh trong hệ sắc ký lỏng-lỏng dễ bị hòa tan bởi pha động nên dễ bị mất mát pha tĩnh trong thời gian sử dụng và gây nhiễm đối với hợp chất phân tích.
Do pha tĩnh của sắc ký lỏng-lỏng dễ tan trong pha động nên người ta không thể ứng dụng phương pháp rửa giải gradient dung môi.
Vì vậy, người ta thường chỉ quan tâm đến loại sắc ký phân bố pha liên kết và phần lớn các loại cột sử dụng hiện nay trong sắc ký phân bố đều có cấu trúc dạng này.
Bề mặt các hạt silica – SiO2 (các hạt này có đường kính 3, 5 hoặc 10 µm) được xử lý (thủy phân) bằng cách đun nóng với HCl 0,1M trong một
hoặc hai ngày để tạo ra những nhóm SiOH như sau (thông thường chỉ có khoảng 8 µmol SiOH/m2 bề mặt):
Hình 1.8: Bề mặt silica đã thủy phân
Sau đó bề mặt silica đã thủy phân này sẽ được cho phản ứng với các organochlorosilan để tạo ra các pha tĩnh không phân cực, phân cực trung bình hoặc rất phân cực tùy theo nhóm R gắn vào.
Hình 1.9: Tạo nhánh trên bề mặt silica
Thường chỉ khoảng 50% nhóm –OH mất H+ để tạo ra HCl (tức < 4µmol/m2 bề mặt bị silan hóa) vì sự kết hợp sẽ dần dần bị ảnh hưởng bởi hiệu ứng lập thể. Ngoài nhóm Cl người ta còn sử dụng –OCH3.
Hợp chất cần phân tích khi đi qua pha tĩnh sẽ bị giữ lại bởi những lực lượng tương tác khác nhau tùy thuộc tính chất, đặc điểm của chất tan và pha tĩnh.
Trong SKPĐ, nhóm thế R trong hợp chất siloxan hầu như không phân cực hoặc ít phân cực. Đó là các ankyl dây dài như C8 (n-octyl), C18 (n- octadecyl) còn gọi là ODS (octadecylsilan) hoặc các nhóm alkyl ngắn hơn như C2; ngoài ra còn có cyclohexyl, phenyl trong đó nhóm phenyl có độ phân cực cao hơn nhóm alkyl. Người ta nhận thấy các alkyl dây dài cho kết quả tách ổn định hơn các loại khác nên đây là loại được sử dụng nhiều nhất.
Hình 1.10: Cấu trúc của cột ODS
Tuy nhiên do hiệu ứng lập thể nên trong cấu trúc của pha tĩnh còn nhóm –OH chưa phản ứng, gây ảnh hưởng xấu đến quá trình tách sắc ký tùy môi trường pH phân tích.
Trong môi trường quá acid (pH < 2) thì có sự phân ly các nhóm ether (-O-Si-C18) ra khỏi nền. Lúc này cột sẽ mất hoạt tính dẫn đến chất cần phân tích không còn tương tác tốt với pha tĩnh nữa.
Trong môi trường bazơ (pH > 7), chính nền silic mang pha tĩnh có thể bị hòa tan (SiO2 thành silicat), hệ quả là số đĩa lý thuyết N giảm và số nhánh ghép cũng giảm, mũi sắc ký rộng ra và thời gian lưu cũng có thể giảm. Kết quả phân tích như vậy sẽ mất đi độ chính xác.
Một trong những cách khắc phục hiện tượng này là dùng các chất như trimethylchlorosilan ClSi(CH3)3 hoặc hexamethyldisilazan (ít sử dụng hơn) để tương tác với nhóm –OH này (gọi là hiện tượng end-capping). Lúc này ta sẽ có loại cột ít tương tác với chất phân tích có tính bazơ (cột LC-DB của hãng SUPELCO).
Hình 1.11: Cấu trúc cột LC-DB
Có một cách khác để loại trừ bớt ảnh hưởng của nhóm –OH mà không cần tương tác với nó là thay những nhóm methyl của –Si(CH3)2-C18 bằng những nhóm thế lớn hơn như isopropyl để những nhóm này sẽ che đi những nhóm –OH, cản trở tương tác của nhóm –OH với chất cần phân tích.
Hình 1.12: Cấu trúc cột có gốc isopropyl
Người ta còn ghép lên dây C18 một số nhóm phân cực để tăng thêm độ phân cực của dây C18, làm cột có khả năng tách chọn lọc hơn đối với những hợp chất phân cực mạnh (cột EPS – Expended Polar Selectivity).
Ngoài sườn silica, thời gian gần đây người ta có sử dụng đến nền nhựa polystyren (Polystyren Reversed Phase – PRP) cho phép phân tích trong môi trường pH từ 1 – 13. Cột này dễ sử dụng trong môi trường acid và bazơ mạnh. [8]
1.8.4. Pha động trong sắc ký pha đảo
Dựa vào các tài liệu, dược điển, thành phần và tính chất của các chất có trong mẫu phân tích ... ta lựa chọn pha động phù hợp để cho quá trình rửa giải tách hoàn toàn các chất có trong mẫu đáp ứng đầy đủ các tiêu chuẩn của Peak đã trình bày đồng thời phải có thời gian phân tích phù hợp nhằm tiết kiệm được dung môi hóa chất, thời gian phân tích mẫu, giảm thiểu sự hoạt động của thiết bị.
Pha động trong sắc ký lỏng nói chung phải đạt những yêu cầu sau: -Hòa tan mẫu phân tích.
-Phù hợp với đầu dò.
-Không hòa tan hay làm mòn pha tĩnh.
-Có độ nhớt thấp để tránh áp suất dội lại cao. -Tinh khiết dùng cho sắc ký (HPLC grade).
Do đó, trong một pha tĩnh đã chọn nếu ta chọn được pha động có thành phần phù hợp thì ta sẽ có hiệu suất tách sắc ký tốt nhất. Đối với hỗn hợp các chất cần phân tích. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
•Pha động phải trơ với pha tĩnh đã có. Không được làm cho pha tĩnh bị biến đổi hóa học.
•Pha động phải hòa tan được các chất phân tích thì mới rửa giải được chúng (đặc biệt phải chú ý khi thay đổi pha động phải rửa cột bằng dung môi phù hợp để không làm tủa các chất có trong cột, hay pha động có sẵn trong cột Ví dụ: đệm phosphat rửa ngay bằng ACN hay MeOH sẽ bị kết tủa trên column).
• Pha động phải bền vững theo thời gian: càng bền lâu càng tốt nhưng ít nhất là chúng là pha động không bị phân hủy trong suốt thời gian phân tích mẫu.
•Phải có độ tinh khiết cao: dung môi cho HPLC, hoá chất tinh khiết phân tích.
•Phải nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký.
•Phải phù hợp với loại Detector: Ví dụ: UV - Vis thì dung môi không được hấp thụ quang (Ví dụ: acid acetic ở bước sáng thấp < 220 nm). Detector huỳnh quang thì dung môi không được phát quang.
• Phải kinh tế, không quá hiếm và đắt.
Trong sắc ký pha đảo, dung môi pha động có độ phân cực cao. Trên lý thuyết chúng ta có thể sử dụng khá nhiều dung môi nhưng kinh nghiệm thực tế cho thấy methanol (MeOH), acetonitrile (ACN) và tetrahydrofuran (THF) là đạt yêu cầu nhất. Nước là một dung môi được cho vào các dung môi hữu cơ để giảm khả năng rửa giải.
Mỗi dung môi đều đặc trưng bởi các hằng số vật lý như chỉ số khúc xạ (refractive index), độ nhớt (viscocity), nhiệt độ sôi (boiling point), độ phân cực (polarity index), độ rửa giải (eluent strength)…
Trong đó độ phân cực và độ rửa giải có tác động lớn lên khả năng phân tách của các mũi sắc ký.
Có ba thông số gây ảnh hưởng lớn đến tách các mũi sắc ký: số đĩa lý thuyết N, hệ số dung lượng K’, độ chọn lọc α . Khi sự thay đổi thành phần pha động không đem lại kết quả tách mũi theo yêu cầu thì chúng ta phải thay đổi bản chất pha động (sử dụng dung môi khác), tức thay đổi α. Đôi khi có thể phải thay đổi cả pha tĩnh.
Trong quá trình tách của SKPĐ, sự tương tác giữa hợp chất cần phân tích và pha động phụ thuộc rất nhiều vào moment lưỡng cực, tính acid (cho proton) hoặc tính bazơ (nhận proton) của dung môi.
Thông thường pha động trong SKPĐ bao gồm một hỗn hợp nước hoặc dung dịch đệm với một hoặc nhiều dung môi hữu cơ phân cực tan được trong nước. Nước là một dung môi rất phân cực nên nó không tương tác với những nhóm alkyl không phân cực trong pha tĩnh, do đó nó được coi như pha động yếu nhất và có tốc độ rửa giải chậm nhất trong tất cả các dung môi động của SKPĐ. Hỗn hợp nước và dung môi hữu cơ thường làm gia tăng độ nhớt dẫn đến việc tăng áp suất cột.
Hình 1.13: Độ nhớt của hỗn hợp nước và dung môi hữu cơ ở 25oC Việc lựa chọn dung môi và thành phần dung môi trong pha động được tối ưu hóa cho những hợp chất cần phân tích. Thông thường, người ta sử dụng hỗn hợp dung môi MeOH/nước trước, rồi ACN/nước hay THF/nước. Với một hỗn hợp chất phân tích phức tạp thì sẽ có sự trộn lẫn của các dung môi hữu cơ với nước. Khi lựa chọn thì phải chọn các hỗn hợp MeOH, ACN và THF với nước có độ rửa giải tương đồng.
Thành phần pha động có thể cố định trong suốt quá trình chạy sắc ký (chế độ isocratic) hoặc được thay đổi theo một chương trình đã định sẵn (chương trình gradien dung môi) để có hiệu quả tách tốt hơn. [5]