fingerprint
Xây dựng fingerprint: Mẫu fingerprint được tạo ra tùy thuộc vào đối tượng nghiên cứu. Mỗi ngành khoa học có tiêu chuẩn đặc trưng riêng cho mẫu fingerprint. Trong đề tài của tôi đề cập đến các tiêu chí để tạo mẫu sắc ký fingerprint phục vụ cho việc đánh giá dược liệu trong y học cổ truyền.
So sánh với tây dược việc đánh giá và quản lý chất lượng không phải là vấn đề đáng quan tâm nhiều vì chất lượng của nguyên liệu đầu vào đã được chuẩn hóa. Đối với thảo dược và các sản phẩm từ thảo dược thì ngược lại, nguyên liệu đầu vào có thể từ một loài thực vật hoặc nhiều loài thực vật, các loài này có thành phần thay đổi theo môi trường sống, mùa thu hoạch, hình thức bảo quản, hình thức xử lý mẫu. Một số được thu thập không chính xác với nguyên nhân là có sự nhầm lẫn do có sự giống nhau về hình thái học của cây trong vùng nơi thu mẫu, một số phát sinh từ sự nhận dạng sai hoặc những sai sót từ các mẫu thực vật nhập khẩu. Một số khó khăn còn nảy sinh từ việc gọi tên các loài thực vật theo các ngôn ngữ địa phương ngay trong cùng một quốc gia hoặc rộng hơn trong một khu vực, các quốc gia. Do đó, bước đầu tiên đóng vai trò quan trọng trong quy trình tạo mẫu sắc ký fingerprint đó là việc chuẩn hóa quá trình thu thập mẫu và xác định tên phân loại dược liệu.
Quá trình thu thập mẫu (Collecting samples): Nhằm giúp cho việc chuẩn hóa nguyên liệu đầu vào, trong cuốn “Hướng dẫn cho phương pháp nghiên cứu, thử nghiệm y học cổ truyền” của Tổ chức Y tế thế giới WHO, người ta chia thảo dược thành các nhóm như sau:
Thảo mộc: Thảo mộc bao gồm những chất liệu thô của thực vật ví dụ như các lá, hoa, quả, gốc, thân, rễ, cành, vỏ.
Chất liệu của thảo mộc: Chất liệu từ thảo mộc bao gồm các thành phần hóa học của thảo mộc, các loài nước ép tươi, chất gôm, tinh dầu, nhựa và những thành phần xuất phát từ thảo mộc.
Thảo mộc đã xử lý: Đây là nguyên liệu đầu vào cho các sản phẩm thảo dược có thể bao gồm các mảnh hoặc bột từ chất liệu của thảo mộc, cao chiết thô. Các nguyên liệu này tạo ra bằng các phương pháp chiết, phân đoạn, ly tâm, hoặc bằng các quá trình vật lý và sinh học khác.
Các sản phẩm từ thảo mộc: Các sản phẩm từ thảo mộc bao gồm một hoặc nhiều phần của thảo mộc đã xử lý từ nhiều nguồn khác nhau. Các sản phẩm này có thể chứa các tá dược nhằm hỗ trợ thêm cho các thành phần có tác dụng.Tuy nhiên, nếu sản phẩm mà có các thành phần thêm vào có nguồn gốc từ tổng hợp nhân tạo hoặc là các hợp chất được phân lập từ thảo mộc thì sản phẩm đó không được công nhận là sản phẩm từ thảo mộc. Một vài thảo dược độc tính rất cao do đó khi thu thập cũng như khi sử dụng cần phải có hướng sử dụng với liều lượng thích hợp. Việc ghi nhãn trên các sản phẩm từ thảo dược không chính xác cũng gây ra nhiều khó khăn trong việc đánh giá và quản lý chất lượng dược liệu. Quá trình thu thập mẫu cần tiến hành theo tiêu chuẩn thu thập mẫu của các nhà thực vật học, ví dụ như: Ghi nhãn tên thảo dược, tiêu bản, chụp ảnh thảo dược, nơi thu thập mẫu và thời gian thu thập mẫu,…
Quá trình xác định tên khoa học của mẫu thu thập được: Việc định loài và xác định tên khoa học chính xác của dược liệu đóng vai trò vô cùng quan trọng, việc này sẽ tránh được sự nhầm lẫn về nguồn gốc thực vật. Bước đầu tiên trong việc đánh giá tính an toàn và hiệu quả của thảo dược là việc xác nhận tên thảo dược. Các thông tin yêu cầu cần thiết là tên Latin, tên đồng nghĩa, tiếp đó là tên theo bản xứ của thảo mộc, những phần của thảo mộc được sử dụng như: gốc, rễ và lá hoặc các phần khác cũng cần được xác định rõ. Bước tiếp theo là ghi rõ các thông tin chỉ dẫn về điều kiện thu thập và môi trường nuôi dưỡng hoặc môi trường sinh sống của thảo mộc. Trong cuốn hướng dẫn về quản lý chất lượng thảo dược của Tổ chức Y tế thế giới WHO đã chỉ rõ các tiêu chí cần thiết.
Quá trình chiết xuất mẫu (Extracting methods): Phương pháp chiết mẫu và chuẩn bị mẫu góp phần quan trọng trong việc tạo ra các sắc ký fingerprint tốt từ thảo dược.
Để có được những bản sắc ký fingerprint tốt, trên bản sắc ký đó hiển thị các thành phần chủ yếu của thảo dược phụ thuộc vào nhiều yếu tố. Ví dụ như: Dung môi chiết, điều kiện tiến hành chiết mẫu, tỷ lệ hệ dung môi chiết mẫu, nhiệt độ tiến hành chiết mẫu, thiết bị sử dụng để chiết mẫu, điều kiện vận hành thiết bị chiết mẫu. Quá trình chuẩn bị mẫu tốt sẽ làm giảm khả năng ảnh hưởng của nhiều thành phần đến kết quả phân tích. Tùy theo từng thiết bị phân tích được lựa chọn (HPLC, CE, GC-MS, LC-MS) để tiến hành xây dựng các bước chuẩn bị mẫu khác nhau cho phù hợp với các thiết bị phân tích nêu trên. Có nhiều mẫu phải tiến hành chiết theo phương pháp chiết lỏng-lỏng (Liquid-Liquid extraction), có mẫu cần phải chiết theo phương pháp chiết pha rắn kết hợp với pha lỏng hoặc nguyên chiết pha rắn (Solid phase extraction)
Hình 1.6 : Sơ đồ lựa chọn hệ dung môi trong quá trình chiết mẫu [4] Để đưa ra được một phương pháp thảo dược tốt, người ta thường tiến hành thử chiết mẫu theo sơ đồ hình 1.6.
Khảo sát hoạt tính sinh học của mẫu (Pharmacological activity): Công việc này được thực hiện theo mục đích tiến hành đánh giá chất lượng dược liệu của từng phòng nghiên cứu. Các hoạt tính sinh học thường được xem xét
Mẫu thảo dược
Mẫu thử
Lựa chọn dung môi
Kết quả chiết
Xây dựng phương pháp chiết Chiết mẫu thử
như: hoạt tính kháng sinh, hoạt tính chống oxi hóa, hoạt tính gây độc tế bào, hoạt tính ức chế sự phát triển xương… việc kiểm soát chất lượng cũng bao gồm cả việc xác định hoạt tính tự nhiên vốn có cũng như cả độc tính của chúng. Việc xác định rõ ràng hoạt tính hoặc độc tính của thảo dược sẽ làm cho các sản phẩm có giá trị cao hơn trong những ứng dụng dược phẩm và thực phẩm. Trong rất nhiều trường hợp, các loại thuốc trong y học cổ truyền được tạo ra từ một hoặc rất nhiều loại thảo dược. Trong các loại thảo dược đó, có loài có độc tính rất cao, có loài không thể hiện hoạt tính. Ngay cả với những loài có độc tính khi sử dụng các loài đó với các liệu pháp phù hợp thì thành phần độc tính trong thảo dược không những không gây độc mà còn đóng vai trò tốt trong liệu pháp chữa bệnh. Chính vì vậy, việc đánh giá và lựa chọn được liều lượng phù hợp cho các thành phần đó cũng là một trong những tiêu chí trong quản lý chất lượng dược liệu.[14]
Lựa chọn thiết bị phân tích (Measurement instruments): Trong các phương pháp đánh giá chất lượng dược liệu, các phương tiện phân tích đóng vai trò quan trọng. Bởi vì việc lựa chọn và sử dụng các phương tiện phân tích phù hợp với đối tượng nghiên cứu sẽ mang lại hiệu quả cao trong quá trình đánh giá chất lượng dược liệu.
- Sau đây là một số thiết bị và công cụ nghiên cứu đang được sử dụng trong việc đánh giá chất lượng dược liệu:
Sắc ký lớp mỏng (TLC): Trước khi có sự ra đời của các thiết bị phân tích hiện đại như sắc ký khí GC và sắc ký lỏng cao áp HPLC, sắc ký lớp mỏng được sử dụng nhiều trong phân tích thảo dược. Sắc ký lớp mỏng có rất nhiều tiện lợi trong việc xây dựng sắc ký fingerprint của thảo dược, phương pháp thực hiện đơn giản, không yêu cầu tiêu chuẩn kỹ thuật cao, linh hoạt, tốc độ phân tích nhanh, độ nhạy đáng tin cậy và việc chuẩn bị mẫu đơn giản, dễ thực hiện trong mọi điều kiện. Tuy nhiên, một vấn đề gặp phải khi sử dụng sắc ký lớp mỏng TLC để đánh giá dược liệu đó là trong mẫu thảo dược thường có nhiều thành phần, các thành phần này có mức độ phức tạp cao, dễ
phân hủy và bay hơi, có nhiều thành phần chồng chéo và ở lượng rất nhỏ thì phương pháp sắc ký lớp mỏng gặp nhiều khó khăn. Hơn thế, dữ liệu của sắc ký lớp mỏng là dữ liệu một chiều không thỏa mãn được yêu cầu của phân tích dữ liệu trong điều kiện hiện nay. Thêm vào đó, việc chuyển dữ liệu để có thể ứng dụng các phương pháp hóa thống kê để tiến hành xử lý số liệu gặp nhiều khó khăn, đôi khi không thể thực hiện được việc chuyển đổi để xử lý số liệu thu được.
Sắc ký khí (GC): Trong thảo dược cũng tồn tại nhiều thành phần, trong đó có thành phần rất dễ bay hơi. Các thành phần rất dễ bay hơi này có những đặc tính riêng biệt của từng loài thảo dược, chính những tính riêng biệt này tạo ưu thế cho việc xây dựng sắc ký fingerprint của các thảo dược theo phương pháp sắc ký khí. Một ví dụ điển hình của việc áp dụng sắc ký fingerprint trên sắc ký khí là phân tích các dạng dầu béo trên hệ sắc ký khí. Kết quả phân tích này cũng cho ra một dạng thích hợp sắc ký fingerprint, dạng fingerprint này có thể được sử dụng để nhận dạng thảo dược. Thành phần và các mối liên hệ của các hợp chất hữu cơ có trong dầu béo chứa đựng những thành phần đặc biệt của thảo dược và một phần tạp chất trong dầu béo có thể được xác định. Phân tích bằng GC cũng thu được sự chính xác và độ nhạy cao cho các thành phần hóa học dễ bay hơi. Tuy nhiên, phương pháp phân tích này cũng gặp khó khăn khi các mẫu thảo dược ở dạng phân cực và không phải là thành phần dễ bay hơi.
Sắc ký lỏng cao áp (HPLC): phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) là một công cụ phân tích khá nổi tiếng, công cụ này được sử dụng nhiều trong các phòng thí nghiệm. Lợi thế của việc sử dụng công cụ HPLC trong việc phân tích các thảo dược bởi vì các thiết bị này rất dễ sử dụng và không bị hạn chế bởi các thành phần bay hơi hay không bay hơi cũng như độ bền, độ phân cực của chất nghiên cứu. Thông thường hệ HPLC thường được sử dụng để phân tích hầu hết các hợp chất có mặt trong thảo dược. Các hợp chất có khả năng hấp thụ quang (chromophic) thì dùng đầu dò UV-Vis hoặc đầu dò hấp phụ
huỳnh quang Fluorescene detector, đối với các hợp chất không có khả năng hấp thụ quang (non-chromophoric) thì dùng đầu dò tán xạ ánh sáng ELSD (evaporative light scattering detector). Các kỹ thuật này rất thích hợp cho việc xây dựng các sắc ký fingerprint và xử lý, chuyển đổi dữ liệu theo các phương pháp thống kê đa biến, kết quả thu được tin cậy và đạt chuẩn mực.
Phương pháp sắc ký điện di (CE): Sắc ký điện di hứa hẹn một tiềm năng trong việc tách và phân tích các thành phần hoạt tính trong thảo dược. Một ưu điểm của phương pháp này là chỉ cần một lượng rất nhỏ mẫu hoặc chất chuẩn, đồng thời phương pháp này đạt tốc độ phân tích rất nhanh và cho khả năng phân tách tốt. Phương pháp xây dựng sắc ký fingerprint trên nền tảng của thiết bị này cũng mang lại kết quả cao bởi vì phần lớn các ứng dụng của sắc ký điện di tương tự như các ứng dụng trong HPLC. Một phần không tiện lợi của phương pháp này là kết quả phân tích vẫn bị ảnh hưởng nhiều bởi một số thành phần nhân tạo hoặc là do việc lựa chọn các dung dịch đệm gây ra.
Các phương pháp phân tích trên thiết bị kết hợp: Trong khi các kết quả phân tích bằng các phương pháp sắc ký thông thường bị hạn chế hoặc không thể thực hiện do nhiều yếu tố tự nhiên hoặc nhân tạo mang lại thì kỹ thuật sắc ký kết hợp như: HPLC-MS, HPLC-NMR, CE-MS, GC-MS… mang lại hiệu quả cao trong kỹ thuật phân tích. Trong nhiều năm gần đây, việc kết hợp giữa hệ thống sắc ký trực tiếp với các hệ khối phổ đang ngày càng thu hút được nhiều sự quan tâm bởi các ứng dụng trong việc xác định và khẳng định sự có mặt của các hợp chất đã biết cũng như một số hợp chất chưa biết cấu trúc trong thảo dược. Hơn thế, dữ liệu phân tích thu được từ hệ thống kết hợp này là dữ liệu hai chiều, dữ liệu này khác hẳn các dữ liệu một chiều thu nhận từ các hệ thống đơn lẻ, dữ liệu hai chiều có thể cung cấp nhiều thông tin hơn, đồng thời dữ liệu hai chiều này cũng được sử dụng nhiều trong phân tích dữ liệu đa chiều bằng phương pháp hóa thống kê (Chemometric).
Hệ kết hợp sắc ký khí và khối phổ GC-MS: Hệ khối phổ là hệ có độ nhạy cao, được sử dụng để phân tích khối lượng. Thông tin mang lại là khối
lượng phân tử cũng như các thông tin có liên quan đến cấu trúc của phân tử. Khi kết hợp giữa sắc ký khí và khối phổ sẽ đạt được những tiện lợi rất cao trong xây dựng sắc ký fingerprint. GC-MS đã được ứng dụng rộng rãi trong việc phân tích tinh dầu có mặt trong thảo dược. Với GC-MS người ta có thể xây dựng không chỉ bản sắc ký fingerprint của tinh dầu với khả năng tách tốt mà còn có những thông tin liên quan đến định tính và định lượng các thành phần có mặt trên bản sắc ký fingerprint, những thông tin này rất hữu ích trong các nghiên cứu đánh giá mối tương quan giữa thành phần hóa học và hoạt tính của thảo dược.
Hệ sắc ký lỏng kết nối đầu dò DAD hoặc ELSD, hệ sắc ký lỏng kết nối khối phổ (HPLC-MS) và hệ sắc ký lỏng kết nối thiết bị NMR (HPLC-NMR): HPLC-DAD đã trở nên rất quen thuộc trong các phòng thí nghiệm trên thế giới. Với những thông tin thu nhận được từ đầu dò DAD hoặc ELSD, việc phân tích định lượng hoặc định tính các thành phần có khả năng hấp thụ quang hoặc không có khả năng hấp thụ quang từ thảo dược trở nên dễ dàng hơn trước đây. Đặc biệt, với sự kết hợp với sắc ký lỏng và khối phổ, hoặc NMR…đã mở ra những hướng đi mới trong phân tích. Hơn thế, kết hợp các kỹ thuật HPLC-DAD-MS mang lại khả năng phân tích cao, thông tin nhiều chiều (thông tin từ đầu dò DAD hoặc ELSD và thông tin từ MS hoặc NMR). Những thông tin từ DAD hoặc ELSD và MS hoặc NMR có thể cung cấp trực tiếp dữ liệu về UV-Vis hoặc MS cho từng giá trị peak riêng lẻ trong một sắc ký đồ. Với sự trợ giúp của hệ thống kết hợp này, các peak trên sắc đồ có thể được so sánh trực tiếp với số liệu trong các thư viện online ACD hoặc CAMAG, với các hợp chất chuẩn để xác định chính xác cấu trúc, thành phần của hợp chất.
Hệ kết hợp giữa sắc ký điện di và các detector khác CE-DAD, CE-MS và CE-NMR…cũng mang lại các ưu điểm tương tự như với các hệ thống kết hợp trên.
Các điều kiện phân tích mẫu (Measurement conditions): Việc tìm điều kiện tối ưu cho các thông số cho quá trình tạo sắc ký fingerprint là nhiệm vụ quan trọng. Tuy nhiên, xác định được thông số có ảnh hưởng đến thí nghiệm là một nhiệ vụ khó khăn, nhất là đối với các hệ thống như:TLC, sắc ký khí, sắc ký khí kết nối khối phổ, sắc ký lỏng hiệu năng cao, sắc ký lỏng cao áp kết nối khối phổ…Trong hệ thống này có rất nhiều thông số có ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm, thay đổi giá trị của một thông số đồng nghĩa với việc tiến hành lại thí nghiệm với thông số đã thay đổi. Mỗi hệ thống có một thông số kỹ thuật riêng, việc lựa chọn và thay đổi các thông số kỹ thuật sẽ làm thay đổi cả quá trình tạo fingerprint. Đối với hệ thống kết hợp, ví dụ như sắc ký lỏng kết nối khối phổ là hệ thống có rất nhiều thông số. Thông thường, người ta không tiến hành việc tìm điều kiện tối ưu đồng thời cho cả hệ thống sắc ký