- Thí nghiệm khảo sât ñược bố trí theo kiểu thí nghiệm một yếu tố tuần t ự không nhắc lại.
3.4.2.ðânh giâ hăm lượng amylose vă kiểm tra gen quy ñịnh hăm lượng amylose th ấp
3.4.2.1 Xâc ñịnh hăm lượng amylose
Hăm lượng amylose ñược phđn tích theo phương phâp của Juliano (dẫn theo N. Dela Cruz vă G.S. Khush,2000) [33] như sau: 100mg bột gạo ñược trộn với 1ml ethanol 95% vă 9ml NaOH 1N, ñun câch thủy hỗn hợp trong nước sôi ñến hóa gel. Hỗn hợp ñược ñể nguội trong 1 giờ rồi lín thể tích bằng nước cất ñến 100ml. Sau ñó, 5ml dung dịch ñược chuyển sang bình khâc, thím văo 1ml acetic acid vă 2ml iodine solution, lín thể tích ñến 100ml, trộn ñều vă ủ ở nhiệt ñộ 36ºC trong 20 phút. Sau khi ủ, dung dịch ñược ño mật ñộ quang ở bước sóng 620mu.
Hăm lượng amylose của câc mẫu giống ñược ñược ñânh giâ theo thang ñiểm của IRRI, 2002 như sau:
Hăm lượng amylose (%) Xếp loại
0 – 2 % Rất thấp (nếp)
3 – 9 % Rất thấp
10 – 19 % Thấp
20 – 25 % Trung bình
Trường ðại học Nông nghiệp Hă Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………30
3.4.2.2 Quy trình PCR kiểm tra gen quy ñịnh hăm lượng amylose thấp
- DNA ñược tâch chiết theo quy trình do Zheng vă cộng sự (1995) ñề xuất tương tự nhưPhần 3.4.1.2
- Cặp mồi PCR Wx-AccI ñược thiết kế dựa trín nghiín cứu của Cai vă cộng sự, 2002 [16] có trình tự như sau:
Wx-R 5’ ATG ATT TAA CGA GAG TTG AA 3’ Wx-F 5’ ACC AT CC TCA GTT CTT TG 3’
- 25 µl phản ứng PCR gồm có: 14.1 µl nước cất, 0.2 µl Taq DNA Polymerase, 2.5 µl 10X buffer, 2 µl 50 mM MgCl2 , 0.2 µl dNTPs 25 mM, 2.5 µl mỗi primer, 1 µl DNA nguyín bản.
- Chu kỳ nhiệt PCR: 95ºC trong 3 phút, 34 chu kỳ: 94ºC trong 45 giđy, 58ºC trong 45 giđy, 72º trong 30 giđy, vă 72º C trong 10 phút.
- Sản phẩm PCR ñược cắt bằng enzyme AccI. 15µl phản ứng gồm có 5µl sản phẩm PCR, 0,25µl enzyme AccI 10unit/ µl, 1,5µ buffer B, 8µl nước. hỗn hợp ñược ủở 37ºC trong 2,5h.
- Sản phẩm PCR ñiện di trín gel agarose 2% . Bản gel ñược nhuộm bằng ethidium bromide vă chụp ảnh dưới tia UV.