Sự phât triển của công nghệ sinh học, ñặc biệt lă công nghệ gen ñê mang ñến những bước tiếng ñâng kể trong nghiín cứu vă chọn tạo giống khâng bệnh bạc lâ. Vi khuẩn Xanthomonas oyzae pv. Oyzae có thể ñược xâc ñịnh nhanh chóngbằng câch sử dụng câc chỉ thị phđn tử. Adachi vă T. Oku (2000) ñề xuất sử dụng 2 ñoạn mồi XOR-F vă XOR-R2 ñể nhđn ñoạn ADN, ñoạn ADN năy nằm giữa hai gen tổng hợp nín cấu tử 16S vă 23 S của ribosome vi khuẩn bạc lâ (dẫn theo Phan Hữu Tôn, 2005) [10].
Ngoăi ra, câc kỹ thuật phđn tử như RFLP (restriction fragment length polymorphism) cũng ñược âp dụng tănh công trong việc xâc ñânh giâ sự ña dạng hay xâc ñịnh chủng mới của vi khuẩn Xoo ở Việt Nam, Phillipnes, Hăn Quốc vă những nước trồng lúa khâc (Adhikari, 1995; Yashitola, 1997; Etham Ghasemie, 2008; Phan Hữu Tôn,2009) [21].
Ngăy nay, ñê có nhiều gen quan trọng của câc loại cđy trồng ñược lập bản ñồ liín kết với câc ñoạn ADN genome, ñặc biệt lă gen khâng bệnh ở câc cđy lương thực chính (Melchinger, 1990; Kelly, 1995; Penner vă cộng sự, 1995; Miklas vă cộng sự, 1996 ) (dẫn theo A.C.Sanchez) [12]. Dựa trín bản ñồ năy, chỉ thị phđn tử xâc ñịnh gen khâng bạc lâ ñê ñược xđy dựng. Kỹ thuật
Trường ðại học Nông nghiệp Hă Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………24 năy ngăy căng ñược sử dụng phổ biến bởi tính khả thi, tính hiệu quả vă tính kinh tế. Chỉ thị phđn tửñê ñược ứng dụng thănh công trong việc xâc ñịnh gen khâng (Nelson vă cộng sự, 1996) [34], trong việc tổ hợp nhiều gen khâng ñể tạo thănh giống chứa ña gen khâng (Huang vă cộng sự, 1997), trong chuyển gen khâng bằng phương phâp nuôi cấy mô, lai tế băo trần (Kelly, 1995).
Tại Việt Nam, chỉ thị phđn tử ñê ñược ứng dụng nhiều trong nghiín cứu bệnh bạc lâ vă chọn tạo giống lúa khâng bệnh ở câc trung tđm chọn giống.
Từ năm 1997-2004, Viện lúa ñồng bằng sông Cửu Long ñê sử dụng phương phâp sử dụng chỉ thị phđn tử kết hợp với lđy nhiễm nhđn tạo bằng 9 race vi khuẩn phổ biến trong ñânh giâ khả năng khâng bệnh của 348 giống lúa ñịa phương thu thập ñược ở duyín hải Trung bộ vă ñồng bằng sông Cửu Long. Kết quả ñê thu ñược 17 giống mang gen xa13, 6 giống mang gen Xa4, 4 giống mang gen xa5, 3 giống mang gen Xa7, 3 giống mang gen Xa14. Kiểm tra ñộ tin cậy của phương phâp chỉ thị phđn tử trong nghiín cứu phât hiện gen khâng ở quần thể con lai giữa IR24/Barer ñối với gen xa5 cho thấy ñộ chính xâc lín tới 93,3% (Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 2004) [1] . Bùi Chí Bửu vă Cộng sự cũng ñê sử dụng chỉ thị phđn tử ñể kiểm tra tổ hợp BC4F4 của IR24 với giống lúa ñịa phương mang gen khâng Xa4, xa5, xa13 với ñộ chính xâcccao[36].
Ở miền Bắc, chỉ thị phđn tử ñê ñược ứng dụng thănh công trong nghiín cứu bệnh bạc lâ vă chọn giống khâng bệnh. Từ năm 2000 cùng với sự hợp tâc của câc chuyín gia Nhật Bản trong khuôn khổ dự ân Jica, nhóm nghiín cứu về bệnh bạc lâ của trường ðại học Nông nghiệp Hă Nội của Phan Hữu Tôn vă cộng sự ñê liín tục công bố nhiều kết quả nghiín cứu quan trọng. Nhóm nghiín cứu ñê sử dụng chỉ thị phđn tử vă kỹ thuật nuôi cấy vi khuẩn ñể tiến hănh thu thập, phđn lập vă bảo quản câc chủng vi khuẩn bạc lâ phổ biến ở
Trường ðại học Nông nghiệp Hă Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………25 miền Bắc. ðồng thời, ñể phục vụ cho chiến lược chọn tạo giống lúa khâng bệnh, Phan Hữu Tôn cũng tiến hănh lđy nhiễm trín câc dòng ñẳng gen nhằm kết luận gen khâng hữu hiệu với câc chủng vi khuẩn ở miền Bắc. Cho ñến nay, câc gen xa5, Xa7, Xa21 ñê ñược xâc ñịnh lă câc gen khâng hầu hết câc chủng vi khuẩn. Câc giống lúa nhập nội từ Trung Quốc cũng ñược tiến hănh ñânh giâ khả năng khâng bệnh, kết quả cho thấy chúng không có khả năng khâng câc chủng vi khuẩn ở Việt Nam [9].
Trong câc năm 2000-2005, Phan Hữu Tôn vă cộng sự tiến hănh việc tìm kiếm nguồn gen khâng từ câc giống lúa ñịa phương bằng cả hai phương phâp lđy nhiễm nhđn tạo vă PCR. Năm 2000, theo kết quả nghiín cứu ñê công bố của Phan Hữu Tôn thì trín cơ sở ñiều tra 145 giống lúa ñịa phương ñê phât hiện ñược 12 giống chứa gen xa5 vă 2 giống chứa gen Xa7. Năm 2004, trín cơ sở tiếp tục ñiều tra 120 giống ñịa phương, Phan Hữu Tôn vă cộng sự phât hiện ñược thím 8 giống lúa ñịa phương chứa gen xa5. Câc kết quả nghiín cứu trín ñều nhằm mục ñích phục vụ cho chiến lược chọn tạo giống lúa chống bệnh bạc lâ ở miền Bắc Việt Nam[3],[4].
ðến nay, bước ñầu có thể khẳng ñịnh câc gen Xa3, Xa4, xa5, Xa7, Xa10, xa13, Xa14 lă câc gen khâng thường có mặt trín câc giống lúa ñịa phương ở Việt Nam. Câc gen khâng Xa4, xa5, Xa7, Xa21 lă câc gen có ý nghĩa quan trọng trong việc chọn tạo giống lúa khâng bệnh, bởi chúng có khả năng khâng ñược hầu hết câc chủng vi khuẩn phổ biến ở nước ta. Nhưng trong số câc gen khâng hữu hiệu, tại miền Bắc thì gen Xa7 có khả năng xuất hiện nhiều hơn xa5. Hiện chưa có nghiín cứu năo công bố việc phât hiện ñược gen Xa21 trín câc giống lúa trồng. Việc sử dụng kỹ thuật PCR xâc ñịnh gen khâng vă vi khuẩn bạc lâ trong chọn tạo giống lúa khâng bệnh cho kết quả rất khả quan
Trường ðại học Nông nghiệp Hă Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………26
Phần thứ ba
NỘI DUNG VĂ PHƯƠNG PHÂP NGHIÍN CỨU 3.1 Nội dung nghiín cứu