Chương 2 : VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP
2.1 VẬT LIỆU:
2.1.4 Vật liệu làm bánh men và rượu:
2.1.4.1 Vật liệu làm bánh men:
Trang 41
Hình 2.1: Bột gạo Hình 2.2: Thuốc bắc
2.1.4.2 Nguyên liệu làm rượu:
Nếp than hoặc nếp, bánh men thuốc bắc.
Hình 2.3: Nếp than Hình 2.4: Nếp Đại hồi Đại hồi Đại hồi Tiểu hồi Quế Thảo quả Sa nhân Sa nhân
Trang 42 Hình 2.5: Bánh men thuốc bắc dạng viên Hình 2.6: Bánh men thuốc bắc dạng bột
2.2 PHƯƠNG PHÁP:
2.2.1 Phương pháp phân lập và làm thuần:
Đồng hóa mẫu: bẻ đôi bánh men, cạo lấy một phần bột ở giữa. Chuẩn bị sẵn erlen có chứa nước cất vô trùng. Lấy phần bột vừa cạo cho vào erlen và sau đó đem lắc trên máy lắc để mẫu được đồng nhất. Sau đó để yên cho phần cặn không tan lắng bớt xuống đáy, dịch huyền phù trong erlen là dịch mẫu thí nghiệm.
Cấy mẫu: Dùng que cấy vòng và lấy 1 vòng que cấy trong dich huyền phù đem ria trên môi trường phân lập đã chuẩn bị sẵn hoặc dùng pipetman có đầu típ hấp khử trùng hút 0.1ml cho vào môi trường , sau đó đem trãi cho tới khô. Nếu mật độ quá dày thì ta có thể pha loãng đến nồng độ cần thiết. Cấy mẫu trên môi trường đặc trưng của nó. Mục đích: Tách rời các tế bào vi sinh vật, tạo khuẩn lạc riêng rẽ.
Chọn những khuẩn lạc đơn chỉ chứa một loại tế bào có hình thái giống nhau và cấy sang đĩa petri khác. Tiếp tục cấy chuyền đến khi có được chủng thuần.
2.2.2 Phương pháp giữ giống:
Phương pháp cấy truyền định kỳ lên môi trường mới: phương pháp này áp dụng để bảo quản tất cả các loại vi sinh vật.
Trang 43 Yêu cầu của phương pháp này là sử dụng dầu khoáng như parafin lỏng hay trung tính, không chứa các sản phẩm độc với vi sinh vật và vô trùng. Cách bảo quản: Khử trùng dầu khoáng bằng cách hấp ở 121°C trong 2h. Sau đó sấy khô ở tủ sấy (110°C) cho đến khi trong. Dùng que cấy đầu hình thước thợ lấy một ít sinh khối cấy vào môi trường thạch nghiêng thích hợp.
Phương pháp giữ giống trong eppendort:
Thu lấy sinh khối cho vào eppendort, bảo quản lạnh 4°C với glycerol 30%.
2.2.3 Phương pháp định danh:
Dùng phương pháp nhuộm màu và quan sát hình thái vi sinh vật. Quan sát đặc điểm sinh học của nấm mốc:
- Đặc điểm của sợi nấm: màu sắc, có vách ngăn hay không có vách ngăn. - Đặc điểm của cơ quan sinh sản: hình dạng, cách sắp xếp các bộ phận của cơ quan sinh sản.
- Hình dạng, cấu tạo, cách sắp xếp của bào tử.
- Nhận xét về hình dạng chung của sợi nấm; vị trí, hình dạng, cách sắp xếp của bào tử, thể bình, cuống thể bình, cuống bào tử đính của giống nấm mốc trên.
Quan sát đặc điểm sinh học của nấm men: - Hình thái, kích thước tế bào nấm men. - Sự nảy chồi của nấm men, sinh hóa.
- Hình dạng, số lượng bào tử trong 1 túi bào tử.
- Định danh bằng phương pháp truyền thống theo các tài liệu có tại bộ môn vi sinh.
2.2.4 Phương pháp khảo sát khả năng phân giải tinh bột của nấm mốc:
Cấy nấm mốc lên môi trường khảo sát khả năng phân giải tinh bột. Sau 7 ngày quan sát : thử khả năng phân giải tinh bột với thuốc thử lugol.
Trang 44
2.2.5 Phương pháp khảo sát khả năng tăng trưởng nấm mốc và nấm men:
Đối với nấm mốc cấy trên 100ml môi trường Sabouraud, sau đó lọc mẫu bằng giấy lọc và đem cân khối lượng nấm mốc. Qua đó xác định sự tăng trưởng của nấm mốc.
Đối với nấm men thì cấy trên 100ml môi trường Hansen, để lắc trên máy lắc, và đếm số lượng tế bào với thời gian xác định.
2.2.6 Phương pháp khảo sát nhiệt độ, pH:
Đối với nấm mốc cấy trên 100ml môi trường Sabouraud và khảo sát ở nhiệt độ 30°C, 37°C , 40°C. Qua đó xác định sự tăng trưởng của nấm mốc ở nhiệt độ thích hợp nhất và dùng nhiệt độ đó để khảo sát pH.
Sau 12 ngày nuôi cấy thì đem cân khối lượng nấm mốc.
Đối với nấm men thì cấy trên ống nghiệm chứa 5ml môi trường Hansen lỏng và khảo sát ở nhiệt độ 30°C, 37°C , 40°C và 1 ngày lắc ống nghiệm 3 lần. Còn khảo sát pH thì ống nghiệm được lắc đều trên máy lắc. Đếm số lượng tế bào sau 1 ngày nuôi cấy để xác định sự tăng trưởng.
Khảo sát ở nhiệt độ 30°C, 37°C bằng tủ ấm, còn ở nhiệt độ 40°C thì dùng tủ khảo sát nhiệt độ tự chế của phòng thí nghiệm.
2.2.7 Phương pháp định lượng đường khử của nấm mốc: phương pháp DNS.
Cấy mốc trên 100ml môi trường dùng định lượng đường khử. Sau khoảng thời gian 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày đem dịch nuôi cấy (sau khi đã lọc) lần lượt đi định lượng đường khử sinh ra.
Nguyên tắc:
Đường khử là các đường chứa nhóm aldehyde (-CHO) hoặc ketone (-CO) như glucose, fructose, arabinose, maltose, lactose; trong khi đó saccharose, trehalose không phải là đường khử.
Phương pháp DNS dựa trên khả năng bắt màu của thuốc thử DNS (acid dinitrosalicylic) với đường khử. Đường khử trong môi trường kiềm nóng sẽ khử thuốc thử DNS màu vàng thành acid 3- amino – 5 – nitrosalicylic màu đỏ da cam.
Trang 45 Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với độ hấp thụ (OD) tại bước sóng 540nm và tỷ lệ thuận với hàm lượng đường khử trong mẫu.
Dựa vào đồ thị chuẩn với nồng độ của N_acetyl_glucose_amin tinh khiết và OD ở 540nm sẽ tính được hàm lượng đường khủ của mẫu nghiên cứu.
Hóa chất và thuốc thử:
- Thuốc thử DNS: cân 10g DNS + 8g NaOH +300ml nước đun ở 500C thêm từ từ 300g muối tarat kép cho đến khi DNS tan hết. Định mức lên cho đủ 1l bảo quản trong chai lọ tối màu.
- Hóa chất: dd N_acetyl_glucose_amin 0.1%: cân 0.1g pha trong 100ml nước cất. Tiến hành xây dựng đường chuẩn DNS:
Từ dung dịch N_acetyl_glucose_amin chuẩn pha các dung dịch có nồng độ từ 0 – 600 µg/ml.
Bảng 2.1 : Cách thực hiện đường chuẩn DNS
Ống nghiệm Đối chứng 1 2 3 4 5 6 Nồng độ(µg/ml) 0 100 200 300 400 500 600 Dung dịch N_acetyl_glucose_amin 0.1%(ml) 0 1 2 3 4 5 6 Nước cất(ml) 10 9 8 7 6 5 4 - Chọn những ống nghiệm có cùng kích cỡ.
Trang 46 - Từ dịch pha loãng trên hút 1ml vào 1 ống nghiệm khác thêm vào 1ml thuốc thử DNS.
- Đun sôi trong vòng 5’ rồi làm lạnh đến nhiệt độ thường. - Thêm vào 5ml nước cất.
- Đo ở bước sóng 540nm.
- Vẽ đồ thị đường chuẩn biểu diễn tương quan giữa nồng độ N_acetyl glucose_amin và hiệu số mật độ quang (∆OD = OD – OD đối chứng).
Tiến hành định lượng dịch đường: làm tương tự như trên, thay dịch pha loãng bằng dịch đường cần đo.
2.2.8 Phương pháp khảo sát khả năng chịu cồn của nấm men:
Cấy nấm men vào môi trường khảo sát khả năng chịu cồn. Quan sát chủng nào có khả năng mọc được trên môi trường có độ cồn cao thì chọn chủng đó để khảo sát hoạt tính và định danh.
2.2.9 Phương pháp khảo sát nồng độ đường thích hợp cho tăng trưởng:
Cấy nấm men vào môi trường khảo sát nồng độ đường thích hợp.
Đối với môi trường thạch thì dùng phương pháp cấy ria và sau vài ngày quan sát bằng mắt thường, nếu là môi trường lỏng thì đếm số lượng tế bào.
Môi trường lỏng : hòa 1-2 khuẩn lạc vào 5ml nước cất, sau đó hút 0.1ml cho vào ống nghiệm chứa 5ml môi trường khảo sát khảo sát nồng độ đường.
2.2.10 Phương pháp đếm số lương tế bào bằng phòng đếm hồng cầu:
Mẫu ở trạng thái lỏng : Pha loãng mẫu theo dãy thập phân:
Trang 47
Đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu :
Đếm số lượng tế bào trong 5 ô lớn (80 ô con) ở phòng đếm hồng cầu, tính số lượng tế bào theo công thức.
Số lượng tế bào /ml = A: số tế bào trong 5 ô lớn (80 ô nhỏ) B:số ô con trong 5 ô lớn = 80
103:số chuyển mm3 thành cm3 hay ml n: số lần pha loãng
Lưu ý: số tế bào trong mỗi ô lớn của buồng đếm phải nằm trong khoảng 10 – 100 để đảm bảo độ chính xác của phương pháp
2.2.11 Phương pháp làm bánh men và nấu rượu:
Bánh men: Theo công thức 1: Bột gạo 1kg, thuốc bắc 20.5gr, nấm mốc 106-108 tế
bào/g, nấm men 106-108 tế bào/g , nước 580ml. Bảng thành phần thuốc Bắc:
Tên Việt Nam Tên Khoa Học Khối lượng
Quế Cinnamomum cassia Blume 7gam
Đại hồi Illicium verum Hook 6gam
Tiểu hồi Noeniculum vulgare Will 5gam
Thảo quả Amomum Tsao – Ko C. et L. 1.5gam
Sa nhân Amomum villoxum Lour 1gam
Thu sinh khối nấm mốc và nấm men.
Nấm mốc + bột gạo sản phẩm 1 đếm số lượng tế bào. Nấm men + bột gạo sản phẩm 2 đếm số lượng tế bào.
Trang 48 Trộn sản phẩm 1 + sản phẩm 2 + thuốc bắc xay nhuyễn bánh men.
Trộn sản phẩm sao cho trong bánh men có chứa số tế bào nấm men là106 /1g bột gạo và số tế bào nấm mố cũng là106 /1g bột gạo.
Lên men rượu: Đối với rượu nếp than:
Gạo nếp than → Xử lý → Nấu chín → làm nguội ↓
Bánh men thuốc bắc → Nghiền mịn → Phối trộn ↓ Lên men ↓ Làm nhuyễn ↓ Hãm cồn ↓ Thành phẩm
Trang 49
Chương 3:
Trang 50
3.1 KẾT QUẢ PHÂN LẬP VÀ LÀM THUẦN:
Từ 7 mẫu bánh men, phân lập được 14 chủng nấm men và 12 chủng nấm mốc.
Bảng 3.1 : Tên chủng nấm men
Nơi thu mẫu bánh men Kí hiệu chủng nấm men phân lập được
Tân An (Long An) TA1, TA2
Bến Lức (Long An) BL1, BL2
Chợ Gò Đen (Long An) GD1, GD2
Chợ Phan Thiết (Bình Thuận) BT1, BT2, BT3 Chợ Phú Thuận (Q7,TP Hồ Chí Minh) PT1,PT2 Chợ Bình Chánh ( Huyện Bình Chánh, TP. Hồ Chí Minh) BC1,BC2 Hà Nội HN1 Bảng 3.2: Tên chủng nấm mốc
Nơi thu mẫu bánh men Kí hiệu chủng nấm mốc phân lập được
Tân An (Long An) ta1
Bến Lức (Long An) bl1, bl2
Chợ Gò Đen (Long An) gd1, gd2
Chợ Phan Thiết (Bình Thuận) bt1, bt2 Chợ Phú Thuận (Q7,TP Hồ Chí Minh) pt1,pt2 Chợ Bình Chánh ( Huyện Bình Chánh,
TP. Hồ Chí Minh)
bc1,bc2
Hà Nội hn1
3.1.1 Hình thái của các chủng nấm men:
Khuẩn lạc sau 3 ngày nuôi cấy trên môi trường Hansen, dưới đây là những đặc điểm sơ bộ:
Trang 51 Tên khuẩn
lạc Hình thái Màu sắc Mép bìa Đặc tính khác
TA1 Bề mặt bóng, khô. Giữa khuẩn lạc có phần nhô cao tạo núm.
Trắng
sữa Trơn Mọc nhô lên thạch
Mặt dưới Mặt trên
Hình 3.1: Hình chủng TA1 sau 3 ngày nuôi cấy Tên khuẩn Tên khuẩn
lạc
Hình thái Màu sắc Mép
bìa
Đặc tính khác
TA2 Bề mặt bóng, nhầy. Giữa khuẩn lạc có phần nhô cao tạo núm.
Trắng ngà
Trơn Mọc nhô lên thạch
Mặt dưới Mặt trên
Trang 52 Tên
khuẩn lạc
Hình thái Màu sắc Mép bìa Đặc tính khác
BL1 Bề mặt bóng, khô, giữa khuẩn lạc có phần nhô cao tạo núm.
Trắng ngà
Trơn Mọc nhô lên thạch
Mặt dưới Mặt trên
Hình 3.3: Hình chủng BL1 sau 3 ngày nuôi cấy Tên khuẩn
lạc
Hình thái Màu sắc Mép bìa Đặc tính
khác BL2 Bề mặt bóng, khô, giữa khuẩn
lạc có phần nhô cao tạo núm
Trắng sữa
Trơn Mọc nhô lên thạch
Mặt dưới Mặt trên
Trang 53 Tên khuẩn lạc Hình thái Màu sắc Mép bìa Đặc tính khác
GD1 Bề mặt bóng,
khô.
Trắng ngà Trơn Mọc nhô lên
thạch
Mặt dưới Mặt trên
Hình 3.5: Hình chủng GD1 sau 3 ngày nuôi cấy
Tên khuẩn lạc Hình thái Màu sắc Mép bìa Đặc tính khác
GD2 Bề mặt bóng,
nhầy.
Trắng sáng Trơn Mọc nhô lên
thạch.
Mặt dưới Mặt trên
Trang 54 Tên khuẩn lạc Hình thái Màu sắc Mép bìa Đặc tính khác BT1 Bề mặt bóng, nhầy. Trắng sáng Trơn Mọc nhô lên thạch
Mặt dưới Mặt trên
Hình 3.7: Hình chủng BT1 sau 3 ngày nuôi cấy
Tên khuẩn lạc Hình thái Màu sắc Mép bìa Đặc tính khác BT2 Bề mặt bóng, giữa khuẩn
lạc có phần nhô cao tạo núm
Trắng sữa (giữa đục)
Trơn Mọc nhô lên thạch
Mặt dưới Mặt trên
Trang 55 Tên khuẩn lạc Hình thái Màu sắc Mép bìa Đặc tính khác
BT3 Bề mặt bóng,
khô.
Cam Trơn Mọc nhô lên
thạch
Mặt dưới Mặt trên
Hình 3.9: Hình chủng BT3 sau 3 ngày nuôi cấy
Tên khuẩn lạc Hình thái Màu sắc Mép bìa Đặc tính khác PT1 Bề mặt bóng, khô, ở
giữa nhô cao và có nhiều lỗ li ti
Trắng ngà Trơn Mọc nhô lên thạch
Mặt dưới Mặt trên
Trang 56 Tên khuẩn lạc Hình thái Màu sắc Mép bìa Đặc tính khác
PT2 Bề mặt bóng,
nhầy.
Trắng sữa Trơn Mọc nhô lên
thạch
Mặt dưới Mặt trên
Hình 3.11: Hình chủng PT2 sau 3 ngày nuôi cấy
Tên khuẩn lạc Hình thái Màu sắc Mép bìa Đặc tính khác
BC1 Bề mặt bóng, khô,
giữa khuẩn lạc có phần nhô cao tạo núm
Trắng sữa Trơn Mọc nhô lên thạch
Mặt dưới Mặt trên
Trang 57 Tên khuẩn lạc Hình thái Màu sắc Mép bìa Đặc tính khác
BC2 Bề mặt bóng,
nhầy.
Trắng sáng Trơn Mọc nhô lên
thạch
Mặt dưới Mặt trên
Hình 3.13: Hình chủng BC2 sau 3 ngày nuôi cấy
Tên khuẩn lạc Hình thái Màu sắc Mép bìa Đặc tính khác
HN1 Bề mặt bóng,
nhầy .
Trắng sáng Trơn Mọc nhô lên
thạch
Mặt dưới Mặt trên
Trang 58
3.1.2 Hình thái của các chủng nấm mốc:
Khuẩn lạc sau 7 ngày nuôi cấy trên môi trường Czapek Dox:
Bảng 3.3: Khuẩn lạc nấm mốc sau 7 ngày nuôi cấy trên môi trường Czapek Dox Số
thứ tự Chủng
Màu sắc Nếp
nhăn
Hình ảnh
Mặt dưới Mặt trên Mặt dưới Mặt trên
1 ta1 Trắng Trắng Không 2 bt1 Trắng và hơi hồng Trắng Có 3 bt2 Trắng Trắng Không 4 bl1 Giữa trắng, xung quanh xanh Giữa trắng, xung quanh xanh Không 5 bl2 Vòng ngoài trắng, trong màu vàng chanh Vòng ngoài trắng, trong màu xanh Có 6 bc1 Vòng ngoài trắng, trong màu hơi vàng Vòng ngoài trắng, trong màu xanh Có 7 bc2 Vòng ngoài trắng, trong màu vàng chanh Vòng ngoài trắng, trong màu xanh Có
Trang 59 8 gd1 Vòng ngoài trắng hồng, trong màu vàng chanh Trắng hơi hồng Không 9 gd2 Trắng Xanh xen kẽ vòng tròn đồng tâm trắng Không 10 pt1 Vòng ngoài trắng, trong màu vàng chanh Vòng ngoài trắng, trong xanh đậm xen kẽ xanh nhạt Có 11 pt2 Vòng ngoài trắng, trong màu hơi vàng Vòng ngoài trắng, trong màu xanh Có 12 hn1 Trắng Trắng Không 3.2 KẾT QUẢ MỘT SỐ KHẢO SÁT VỀ NẤM MỐC:
3.2.1 Kết quả khảo sát khả năng phân giải tinh bột của nấm mốc:
Kết quả khảo sát 12 chủng nấm mốc sau 5 ngày nuôi cấy thì có 10 chủng nấm mốc có vòng phân giải.
Trang 60 Bảng 3. 4 : Bảng kết quả khảo sát khả năng phân giải tinh bột của nấm mốc
Chủng Thử lugol Đường kính khuẩn lạc (cm) Đường kính vòng phân giải+ khuẩn lạc (cm) Đường kính vòng tan (cm) Hình ảnh ta1 - bt1 + 2.2 3.0 0.8 bt2 + 0.3 3.1 2.8 bl1 + 0.3 1.4 1.1 bl2 + 1.1 4.5 3.4 bc1 + 1.2 3.0 1.8 bc2 + 1.1 2.8 1.7 gd1 + 1.7 2.5 0.8
Trang 61
gd2 + 1.5 3.5 2.0
pt1 + 1.1 2.7 1.6
pt2 + 1.3 3.0 1.7
hn1 -
Chú thích: + : Có xuất hiện vòng phân giải. - : Không xuất hiện vòng phân giải.
Nhận xét: dựa vào bảng kết quả trên thì chúng tôi nhận thấy có 2 chủng có vòng phân giải lớn là bt2: 2.8 cm và bl2: 3.4 cm.
Tuy nhiên, kết quả này chỉ mang tính chất định tính, vì nó còn tùy thuộc vào hàm lượng tinh bột phân bố trong môi trường. Do đó chỉ có thể so sánh khả năng phân giải tinh bột một cách tương đối. Nhưng dựa vào kết quả sơ bộ trên, chúng tôi có thể chọn 2 chủng có vòng phân giải lớn hơn các chủng khác để tiếp tục khảo sát, đó là chủng bt2 và bl2.
3.2.2 Kết quả định danh nấm mốc:
Kết quả định danh và làm tiêu bản của 10 chủng nấm mốc có khả năng phân