Chương 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.4.1.1Quá trình vi sinh vật:
1.4 QUÁ TRÌNH LÊN MEN RƯỢU
1.4.1.1Quá trình vi sinh vật:
Thực chất của quá trình này là quá trình sinh sản và sinh trưởng của vi sinh vật. Quá trình này xảy ra rất nhanh ở giai đoạn đầu lên men, khi cho bánh men thuốc bắc vào nguyên liệu. Sự phát triển mạnh của các vi khuẩn giai đoạn này kéo theo sự tạo thành một số axit hữu cơ. Kết quả là pH môi trường giảm xuống tạo điều kiện thuận lợi cho các loài nấm mốc phát triển. Song song đó là các loài nấm men bắt đầu phát triển tuy với tốc độ yếu hơn.
Các loài nấm mốc chỉ phát triển mạnh trong giai đoạn đường được tạo thành, hay đúng hơn là cuối của giai đoạn nấm mốc phát triển. Việc phân rõ ràng các giai đoạn phát triển của vi khuẩn, nấm mốc, nấm men rất khó vì thực tế việc phát triển của các loài vi sinh vật trong khối lên men diễn ra đồng thời. Chỉ có một điều khẳng định là sự phát triển không cùng một mức độ.
Sự phát triển của một số vi khuẩn, nấm mốc đòi hỏi sự có mặt một lượng ôxy nhất định trong môi trường, chính vì thế các loài vi sinh vật này phát triển mạnh ở giai đoạn đầu. Nấm men cũng cần sự có mặt của ôxy để tăng sinh khối, tuy nhiên mức độ không cao như của nấm mốc. Mặt khác nấm men phát triển cần đường, do đó cần có thời gian để nấm mốc chuyển hóa đường từ tinh bột.
Trang 26
1.4.1.2 Lên men có ba quá trình sinh hóa cơ bản:
Quá trình chuyển hóa tinh bột thành đường (đường hóa): chủ yếu là dưới tác dụng của enzyme amylase do phần lớn nấm mốc tạo ra.
Quá trình chuyển hóa đường thành rượu (rượu hóa): Các phân tử đường vừa được tạo ra lại trở thành thức ăn cho nấm men sử dụng để thực hiện quá trình lên men rượu tạo thành rượu etylic và CO2. Quá trình rượu hóa diễn ra trong điều kiện yếm khí (điều kiện không có mặt của oxy).
Quá trình chuyển đường và các thành phần khác thành các axit hữu cơ: trong đó có 2 quá trình tạo axit hữu cơ cơ bản: quá trình tạo axit acetic và axit lactic. Quá trình tạo axit lactic mạnh hơn, cả hai quá trình này xảy ra với cường độ không mạnh ở giai đoạn đầu vì lượng đường tạo thành trong khối lên men chưa cao.
1.4.2 Quá trình thủy phân tinh bột (đường hóa):
Enzym amylase có trong nấm mốc thủy phân các phân tử tinh bột bằng cách thủy phân liên kết α-D (1,4) glycozit. Đặc trưng của phản ứng này là sự giảm nhanh độ nhớt và sinh ra đường[11]. Amylase thủy phân tinh bột thành glucose, maltose và dextrin hạn chế.
liên kết α-(1-4)
Trang 27 Amylopectin
Hình1.5: Cấu trúc amylose, amylopectin và các vị trí tác động của enzym amylase
Hình 1.6: Phản ứng thủy phân
1.4.2.1 Đặc tính và cơ chế tác dụng của enzyme amylase:
Đặc tính enzyme α-amylase (α-1,4-glucanohydrolase) (EC 3.2.1.1): α- amylase từ các nguồn khác nhau có thành phần amino acid khác nhau, mỗi loại α- amylase có một tổ hợp amino acid đặc hiệu riêng. α-amylase là một protein giàu tyrosine, tryptophan, acid glutamic và aspartic.
Cơ chế tác dụng của enzyme α-amylase (α-1,4-glucanohydrolase) (EC 3.2.1.1): α-amylase từ các nguồn khác nhau nhưng cơ chế tác dụng có nhiều điềm rất giống nhau. α-amylase có khả năng phân cắt các liên kết α-1,4-glucozit nằm ở
liên kết α-(1-6)
Trang 28 phía bên trong phân tử cơ chất (tinh bột hoặc glycogen) một cách ngẫu nhiên, không theo một trật tự nào cả. α-amylase không chỉ thủy phân hồ tinh bột mà nó thủy phân cả hạt tinh bột nguyên song với tốc độ rất chậm.
Tóm lại, dưới tác dụng của α-amylase, tinh bột có thể chuyển thành maltotetrose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp. Tuy nhiên, thông thường α- amylase chỉ thủy phân tinh bột chủ yếu thành dextrin phân tử thấp (không cho màu với Iodine) và một ít maltose. Khả năng dextrin hóa cao của α-amylase là tính chất đặc trưng của nó. Vì vậy, người ta thường gọi loại amylase này là amylase dextrin hóa hay amylase dịch hóa.
Tinh bột Dextrin + maltose + glucose [25]
1.4.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme amylase:
Enzyme α-amylase (α-1,4-glucanohydrolase) (EC 3.2.1.1):
Điều kiện hoạt động của α-amylase từ các nguồn khác nhau thường không giống nhau. pH tối thích cho hoạt động của α-amylase từ nấm sợi là 4,0 - 4,8.
Độ bền đối với tác dụng của acid cũng khác khác nhau. Ở pH= 3,6 và 0°C, α- amylase của malt bị vô hoạt hoàn toàn sau 15 - 30 phút; trong khi đó hoạt lực của α- amylase của nấm sợi hình như không giảm bao nhiêu. Trong dung dịch α-amylase nấm sợi bảo quản tốt ở pH= 5,0 - 5,5.
Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác của α-amylase từ các nguồn khác nhau cũng không đồng nhất, α-amylase của nấm sợi rất nhạy cảm đối với tác động nhiệt. Nhiệt độ tối thích của nó là 50°C và bị vô hoạt ở 70°C.
1.4.3 Quá trình chuyển hóa đường thành rượu ( rượu hóa):
Quá trình rượu hóa được thực hiện bởi Saccharomyces sp., Endomycopsis sp.
Trong đó các loài nấm men Saccharomyces đóng vai trò cơ bản. Song song với quá trình này là các quá trình chuyển hóa đường, các axit hữu cơ thành các sản phẩm phụ khác. Quá trình này diễn ra trong điều kiện yếm khí, do đó vào khoảng ngày thứ
Trang 29 2 trong thời gian lên men, toàn bộ khối lên men cần được đậy kín nhằm tạo điều kiện thích hợp cho nấm men hoạt động hiệu quả hơn.
Quá trình này diễn ra do nấm men sử dụng đường để tạo thành rượu etylic và CO2. CO2 sinh ra trong quá trình lên men sẽ tạo thành bọt khí bám vào bề mặt nấm men và làm các tế bào nấm men nổi lên trên, khi lên đến bề mặt, bọt khí vỡ ra và tế bào nấm men lại chìm xuống tạo ra sự đảo trộn giúp quá trình lên men được tốt hơn. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
1.4.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến lên men rượu:
1.4.4.1 Nấm men chỉ có khả năng lên men các loại đường monoza và disaccarit.
Với các loại saccharit thường gặp là maltose và saccarose thì nấm men có khả năng tạo thành enzyme tương ứng là sacarase và maltase thủy phân các disaccharit thành glucose và frutose. Nấm men Saccharomyces hoàn toàn không có khả năng lên men rượu từ tinh bột và các polysaccarit khác [21] [22].
1.4.4.2 Nồng độ đường:
Ảnh hưởng rất lớn đến hiệu suất lên men, nấm men chỉ có khả năng lên men đường thành rượu trong khoảng nồng độ đường phù hợp từ 10 - 15%. Nếu nồng độ đường quá cao sẽ ức chế nấm men, và năng lực lên men rượu giảm, khi nồng độ đường từ 30 -35% thì sự lên men gần như đình chỉ. Tuy nhiên, khi nồng độ đường quá thấp cũng làm giảm năng lực lên men và không có lợi về mặt kinh tế [21] [22].
1.4.4.3 Ảnh hưởng của oxy:
Nấm men trong điều kiện kị khí sẽ thực hiện quá trình lên men rượu, trong lên men rượu ở giai đoạn đầu cần tạo điều kiện hiếu khí để nấm men sinh trưởng và phát triển đầy đủ lượng tế bào cần thiết cho quá trình lên men rượu [21] [22].
1.4.4.4 Ảnh hưởng của pH:
Nếu ở pH từ 4 - 5 thì sự lên men rượu tạo sản phẩm chính là etanol, còn nếu ở pH kiềm sản phẩm chính lại là glyxerin. Trong quá trình lên men rượu người ta có thể điều chỉnh pH bằng acid H2SO4 hoặc acid lactic [21] [22]. pH tối ưu để tạo cồn là 4,5-5,0. pH thích hợp khoảng 4,8-5,2 để đường hóa diễn ra.
Trang 30 Thông thường nhiệt độ phù hợp cho sự lên men là 28 - 30°C. Ở nhiệt độ trên 50°C và dưới 0°C thì sự lên men hầu như đình chỉ [21] [22]. Nhiệt độ thấp: khả năng lên men cao, kéo dài, hạn chế tạp khuẩn. Nhiệt độ cao: hoạt tính của nấm men sẽ giảm nhanh, dễ bị nhiễm khuẩn, tạo nhiều ester, aldehyd và tổn thất rượu theo CO2 sẽ tăng.
1.4.4.6 Ảnh hưởng của nồng độ rượu tạo thành:
Thông thường, nấm men lên men đến độ rượu đạt 12 – 14%. Một số ít nấm men đạt nồng độ rượu 17 – 20%, với nồng độ rượu cao hơn sẽ ức chế nấm men và hầm như kìm hãm sự lên men [21] [22].
1.4.4.7 Ảnh hưởng của CO2:
Khí CO2 sinh ra trong quá trình lên men rượu, việc tồn trữ CO2 trong môi trường lên men sẽ ức chế quá trình lên men rượu. Song việc thoát khí CO2 lại tăng cường quá trình lên men. Bởi lẽ sự thoát khí CO2 làm cho môi trường khuấy trộn đều, kéo dài trạng thái lơ lửng của nấm men, do đó làm tăng sự lên men [21] [22].
1.4.4.8 Số lượng men giống:
Thích hợp: 10% thể tích thùng lên men. Số lượng men giống nhiều: tạo rượu nhanh, nhưng chất lượng không tốt. Số lượng men giống ít: tạo rượu chậm, có thể dễ bị nhiễm và rượu có vị chua.
1.4.4.9 Nồng độ ethanol:
Ethanol là sản phẩm chính của lên men. Ức chế hoạt động của nấm men. Nồng độ cồn tối đa khoảng 14-16%.
1.4.4.10 Thời gian lên men:
Thời gian lên men phụ thuộc nhiều yếu tố và ảnh hưởng nhiều đến chất lượng rượu về mùi, vị, tạp chất,…
Trang 31
1.5 VI SINH VẬT THAM GIA VÀO QUÁ TRÌNH LÊN MEN:
1.5.1 Nấm mốc:
1.5.1.1 Khái quát:
Nấm mốc là loại nấm sợi điển hình vi sinh vật chân hạch, ở thể tản, tế bào không có diệp lục tố, một số sống cộng sinh với thực vật, khi cộng sinh với tảo đơn bào hoặc tập hợp đơn bào thì hình thành địa y. Vách tế bào cấu tạo chủ yếu là chitin, có hay không có celuloz và một số thành phần khác có hàm lượng thấp.
Nấm mốc có kích thước nhỏ, không có quả thể, không có sắc tố, thuộc nhóm nấm bất toàn, chúng có đời sống dị dưỡng (kí sinh hoặc hoại sinh) [23].
1.5.1.2 Vai trò:
Trong quá trình lên men rượu từ nguyên liệu tinh bột thì nấm mốc có vai trò là thủy phân tinh bột thành đường nhờ hệ enzyme amylase. Tùy vào từng phương pháp khác nhau mà người ta dùng các giống nấm mốc khác nhau.
Đối với phương pháp men thuốc bắc và amylo thì thường dùng các nấm mốc thuộc giống Mucor sp. va Rhizopus sp. để thực hiện quá trình đường hóa. Đối với phương pháp myco-malt thì dùng các loài nấm mốc thuộc giống Aspergillus [16].
1.5.1.3 Điều kiện phát triển: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hầu hết các loài nấm mốc không cần ánh sáng trong quá trình sinh trưởng. Tuy nhiên, có một số loài lại cần ánh sáng trong quá trình tạo bào tử. Nhiệt độ tối thiểu cần cho sự phát triển là từ 2°C đến 5°C, tối hảo từ 22°C đến 27°C. Nấm mốc có thể phát triển tốt ở môi trường acid (pH=6) nhưng pH tối hảo là 5 - 6,5 [4].
Oxi cũng cần cho sự phát triển của nấm mốc vì chúng là nhóm hiếu khí bắt buộc. Nấm mốc không có diệp lục tố nên chúng cần được cung cấp dinh dưỡng từ bên ngoài (nhóm dị dưỡng), một số sống sót và phát triển nhờ khả năng ký sinh (sống ký sinh trong cơ thể động vật hay thực vật) hay hoại sinh (saprophytes) trên
Trang 32 xác bã hữu cơ, cũng có nhóm nấm rễ hay địa y sống cộng sinh với nhóm thực vật nhất định. Theo Alexopoulos và Mims (1979) cho biết nguồn dưỡng chất cần thiết cho nấm được xếp theo thứ tự sau: C, O, H, N P, K, Mg, S, B, Mn, Cu, Zn, Fe, Mo và Ca [4].
1.5.1.4 Các loài nấm mốc thường gặp trong công nghệ lên men
Một số nấm mốc thường gặp trong lên men: Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus usami, Aspergillus oryzae, Mucor sp., Rhizopus, Penicillium.
1.5.2 Nấm men:
1.5.2.1 Khái quát:
Nấm men là nấm đơn bào, có nhân thật, thường có hình bầu dục, tuy nhiên tùy loài mà tế bào nấm men có thể có hình cầu, hình trứng, hình elip, ... Kích thước tế bào nấm men lớn gấp 10 lần vi khuẩn, đường kính khoảng từ 1-5μm và dài khoảng 5-30μm . Các loài nấm men có khuẩn ty hoặc khuẩn ty giả [15].
Thành tế bào nấm men có đến 80% là polysaccharide, trong đó các hợp chất mannan, glucan và chitine là rất quan trọng, một lượng nhỏ lipit, phần còn lại là protein có thể đến 10 - 20%, trong đó gần một nữa là mannoprotein, chúng tạo thành 3 lớp của thành tế bào nấm men.
Màng tế bào chất cấu tạo chủ yếu là protein (50% khối lượng khô), còn lại là lipit (40%) và một ít polisaccarit. Nhân của tế bào nấm men được bao bọc bởi một màng nhân như ở các sinh vật có nhân thật khác. Màng nhân có cấu trúc hai lớp và có rất nhiều lỗ thủng. Ti thể của nấm men cũng giống như các nấm sợi và các sinh vật có nhân khác. Các tế bào nấm men khi già sẽ xuất hiện không bào chứa các enzim thủy phân, poliphotphat, lipoit, ion kim loại… [15]
Trong sản xuất rượu thường sử dụng nấm men Saccharomyces cerevisiae. Saccharomyces cerevisiae là loài nấm men lên men nổi, có hình dạng chủ yếu hình cầu hoặc ovan với kích thước 5 - 10μm. Thời gian thế hệ của Saccharomyces
Trang 33
cerevisiae là 120 phút. Đây là đặc điểm quan trọng được con người lợi dụng để sản xuất nhiều sản phẩm hữu ích như rượu, bia.
Nói chung nấm men thường ở trạng thái đơn bào, đa số sinh sản theo cách nảy chồi, cũng có khi sinh sản theo lối phân cắt tế bào, nhiều loại có khả năng lên men đường, thành tế bào có chứa mannan, thích nghi với môi trường có nồng độ đường cao và có tính acid.
Hình 1.7: Nấm men Saccharomyces cerevisiae
Nấm men phân bố rộng rãi trong tự nhiên, nhất là trong môi trường có chứa đường, có pH thấp, chẳng hạn như trong hoa quả, rau dưa, mật mía, rỉ đường, …
1.5.2.2 Vai trò:
Trong sản xuất rượu người ta thường dùng những chủng nấm men thuộc giống Saccharomyces spp., các chủng nấm men lên men rượu cần phải có những tính chất sau:
-Có sức phát triển mạnh trong dịch đường lên men.
-Có khả năng tiết ra hệ enzyme zyma nhiều để lên men nhanh và hoàn toàn. -Có thể lên men được ở nhiệt độ đối cao.
-Có khả năng chịu được độ cồn cao trong quá trình lên men. -Chịu được môi trường có độ axit cao.
Trang 34
1.5.2.3 Điều kiện phát triển:
Trong quá trình sinh trưởng và phát triển nấm men cần những nguồn dinh dưỡng như: nguồn cacbon thường là các loại đường, nguồn nitơ, các nguyên tố khoáng và các chất sinh trưởng.
Saccharomyces cerevisiae: là loài thường dùng trong lên men, có khả năng lên men nhiều loại đường khác nhau như glucose, maltose, galactose. Chúng có khả năng lên men ở nhiệt độ cao (36 ÷ 40°C), có khả năng chịu được độ axit. Đặc điểm quan trọng hơn hết đó là có khả năng lên men nhiều loại nguyên liệu khác nhau như gạo, ngô, khoai, sắn, với lượng đường trong dung dịch từ 12 ÷14% có khi 16 ÷18%. Nồng độ rượu trong dung dịch lên men 10 ÷12%. Nhiệt độ lên men thích hợp là 28 ÷ 32°C [9].
Đặc biệt chúng có khả năng chịu được thuốc sát trùng Na2SiF6 với nồng độ 0,02 ÷ 0,025%. Đặc điểm này rất thuận lợi cho lên men khi cần sử dụng thuốc sát trùng [9].
Trang 35
Chương 2:
Trang 36
2.1 VẬT LIỆU: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.1.1 Bánh men thuốc bắc:
Bánh men thu được từ các vùng khác nhau: Tân An (Long An)
Bến Lức (Long An) Chợ Gò Đen (Long An) Chợ Phan Thiết (Bình Thuận)
Chợ Phú Thuận (Q7, TP. Hồ Chí Minh) Chợ Bình Chánh ( Huyện Bình Chánh, TP. Hồ Chí Minh) Hà Nội 2.1.2 Hóa chất,dụng cụ và thiết bị: 2.1.2.1 Hóa chất: - Lugol
- Phẩm nhuộm lacto phenol. - Coton blue.
2.1.2.2 Dụng cụ và thiết bị:
- Dụng cụ: Erlen, becher, ống nghiệm, petri, pipette vạch, pipette bầu, ống đong, micropipette, đầu típ, đũa khuấy, que cấy, đèn cồn,….
- Thiết bị: nồi hấp autoclave, bếp điện, máy vortex, cân điện tử, máy đo quang phổ, máy đo pH, máy lắc, máy ly tâm, tủ cấy, tủ sấy, tủ lạnh.
2.1.3 Môi trường:
2.1.3.1 Môi trường phân lập và làm thuần:
Môi trường phân lập và làm thuần nấm men:
Trang 37 Pepton 10g Glucose 50g KH2PO4 3g MgSO4 3g Agar 20g Nước cất 1000ml pH = 6,0
Môi trường Sabouraud
Pepton 10g
Glucose 40g
Nước cất 1000ml
pH = 6,0
Môi trường phân lập và làm thuần nấm mốc:
Môi trường khoai tây-Glucose-Agar (PGA)
Khoai tây 200g
Glucose 20g
Agar 20g
Nước cất 1000ml
pH = 6,5
Môi trường Czapek – Dox