Chương 2 : VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP
2.2.7Phương pháp định lượng đường khử của nấm mốc:
2.2 PHƯƠNG PHÁP:
2.2.7Phương pháp định lượng đường khử của nấm mốc:
Cấy mốc trên 100ml môi trường dùng định lượng đường khử. Sau khoảng thời gian 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày đem dịch nuôi cấy (sau khi đã lọc) lần lượt đi định lượng đường khử sinh ra.
Nguyên tắc:
Đường khử là các đường chứa nhóm aldehyde (-CHO) hoặc ketone (-CO) như glucose, fructose, arabinose, maltose, lactose; trong khi đó saccharose, trehalose không phải là đường khử.
Phương pháp DNS dựa trên khả năng bắt màu của thuốc thử DNS (acid dinitrosalicylic) với đường khử. Đường khử trong môi trường kiềm nóng sẽ khử thuốc thử DNS màu vàng thành acid 3- amino – 5 – nitrosalicylic màu đỏ da cam.
Trang 45 Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với độ hấp thụ (OD) tại bước sóng 540nm và tỷ lệ thuận với hàm lượng đường khử trong mẫu.
Dựa vào đồ thị chuẩn với nồng độ của N_acetyl_glucose_amin tinh khiết và OD ở 540nm sẽ tính được hàm lượng đường khủ của mẫu nghiên cứu.
Hóa chất và thuốc thử:
- Thuốc thử DNS: cân 10g DNS + 8g NaOH +300ml nước đun ở 500C thêm từ từ 300g muối tarat kép cho đến khi DNS tan hết. Định mức lên cho đủ 1l bảo quản trong chai lọ tối màu.
- Hóa chất: dd N_acetyl_glucose_amin 0.1%: cân 0.1g pha trong 100ml nước cất. Tiến hành xây dựng đường chuẩn DNS:
Từ dung dịch N_acetyl_glucose_amin chuẩn pha các dung dịch có nồng độ từ 0 – 600 µg/ml.
Bảng 2.1 : Cách thực hiện đường chuẩn DNS
Ống nghiệm Đối chứng 1 2 3 4 5 6 Nồng độ(µg/ml) 0 100 200 300 400 500 600 Dung dịch N_acetyl_glucose_amin 0.1%(ml) 0 1 2 3 4 5 6 Nước cất(ml) 10 9 8 7 6 5 4 - Chọn những ống nghiệm có cùng kích cỡ.
Trang 46 - Từ dịch pha loãng trên hút 1ml vào 1 ống nghiệm khác thêm vào 1ml thuốc thử DNS.
- Đun sôi trong vòng 5’ rồi làm lạnh đến nhiệt độ thường. - Thêm vào 5ml nước cất.
- Đo ở bước sóng 540nm.
- Vẽ đồ thị đường chuẩn biểu diễn tương quan giữa nồng độ N_acetyl glucose_amin và hiệu số mật độ quang (∆OD = OD – OD đối chứng).
Tiến hành định lượng dịch đường: làm tương tự như trên, thay dịch pha loãng bằng dịch đường cần đo.