Trong những hợp chất hữu cơ phi Chlor thì có những chất đang bị nghi ngờ là những hooc môn môi trường. Đó không chỉ là nhựa, bột giặt, mà còn một phần nhỏ chưa phản ứng, chất phụ gia có trong nhựa, và chất phân giải trong bột giặt.
• p-Nonilphenol
Hình 4-11 Cấu trúc chất hoạt tính bề mặt phi ion thuộc loại alkylphenol và chất thay thế sau phân giải p-nonilphenol (nói tắt là nonilphenol) khi kết hợp với polyetel như polyetyrenegricol là chất có hoạt tính bề mặt, được sử dụng làm chất giặt tẩy. Cấu trúc hóa học như hình 4-11. Vì phần nonilphenol có tính tan trong dầu, còn vòng polyetel mang tính gần nước nên có tính năng chất tẩy hoạt tính bề mặt phi ion không tĩnh điện.
Nói là độc nhưng không phải do chất giặt tẩy hoạt tính bề mặt mà do sau khi phân giải sẽ sinh ra chất nonilphenol. Nước giặt thải cùng với nước thải khi ra sông sẽ dễ dàng bị phân giải nhờ các vi sinh vật . Bảng 4-12 là kết quả phân tích ở các sông của Anh. Đặc biệt, kết quả phân tích ở sông Aire có nồng độ nonilphenol cao. Vì ở dọc sông này, nhà máy làm sạch lông cừu đã sử dụng một lượng lớn thuốc tẩy thuộc loại nonilphenol. Nhưng chúng ta cũng không quên một điều rằng trong nước tiểu thải ra của con người và động vật có chứa một lượng hooc môn estrogen đáng kể.
Bảng 4-12 Nồng độ nonilphenol tại 3 con sông của Anh (Harries,1997) Lượng nonilphenol( µｇ/l) Địa điểm
Từ bùn đáy sông Từ nước sông Sông Aire 12km thượng lưu
Khu xử lý nước thải o,4km về hạ lưu Dưới 1,6 330 130 Dưới 1,6 -- 25 Sông Allan Khu xử lý nước dưới
Horsham Vùng Welkrosgrenge 2,9 0,9 12 Dưới 0,2
Sông Lee Laton
Gần Harpenden 1,0 Dưới 0.9 0,5 1,1
Nếu tồn tại một lượng nonilphenol trong nước dù rất nhỏ cũng gây ảnh hưởng xấu đến hệ sinh sản của cá. Một chỉ tiêu đánh giá hay được sử dụng là lượng vitellogenin được tổng hợp từ gan của cá. Vitellogenin là protein trước khi hình thành lòng đỏ trứng. Chất estradiol được tổng hợptại buồng trứng cá cái non, theo mạch máu đến gan, chỉ định gan tổng hợpchất vitellogenin. Như vậy, nếu chất có tác dụng estrogen lẫn vào cơ thể cá đực thì cũng thúc đẩy việc hình thành chất vitellogenin.
hình 4-13 Nồng độ vitellogenin trong cơ thể cá hồi sinh sống ở sông của Anh (Harries,1997)
chất vitellogenin như hình 4-13 . Cách đo nồng độ vitellogenin là thả 2 lồng thép, mỗi lồng 10con cá hồi vằn
đực xuống khu vực nước cần khảo sát, sau đó 3 tuần thì vớt lên và đo nồng độ. Từ hình 4-13 cho ta thấy cá ở những khu vực gần miệng cống nước thải của khu xử lý có nồng độ vitellogenin cao hơn hẳn so với cá ở thượng nguồn. Điều đó có nghĩa là gần khu xử lý nồng độ chất có tác dụng estrogen cao.
Ở Nhật Bản, thiết bị đo nồng độ vitellogenin cũng được bán trên thị trường nhưng việc sản xuất bột giặt gia dụng dùng nonilphenol làm nguyên liệu thì đều do các nhà sản xuất lớn tự quy định.
Như ở hình 4-11 vì chất nonilphenol có các vòng benzen đều kết hợp với gốc(-OH) nên dễ chịu phản ứng hóa hợp nhờ các enzim trong gan, và cũng dễ bị thải ra ngoài cơ thể động vật. Thực tế như bảng so sánh 4-14 chất nonilphenol là chất có hoạt tính estrogen yếu hơn so với các hooc môn môi trường khác, thế mà cũng đã gây ảnh hưởng xấu đến các loài cá thì có nghĩa là nước sông ở Anh bị ô nhiễm rất nghiêm trọng. Hoạt tính estrogen của DES không khác mấy so với estradiol.
Bảng 4-14 cũng biểu thị kết quả về sự thay đổi trọng lượng tử cung của chuột. Khi tiêm 5 nanogram estradiol vào chuột thì trọng lượng tử cung chuột tăng lên 2 lần.
Bảng 4-14 Ảnh hưởng của các hooc môn môi trường đến trọng lượng tử cung chuột, so sánh và đánh giá theo phương pháp nấm men tái tổ hợp( Nhóm Coldham, 1997)
Chất hóa học Lượng tiêm Trọng lượng tử cung/
trọng lượng cơ thể Hoạt tính estrogen (pp enzim)
Trước khi tiêm 0 0,097 ---
17β estradiol 5ng 0,172 100 DES 5ng 0,137 74,3 Nonilphenol 1mg 0,094 0,005 Octylphenol 1mg 0,097 0,003 Kumestrol 1mg 0,104 0,67 Benzylbutyl phthalate 5mg 0,108 0,0004 Phthalate dibutyl 5mg 0,091 0 Zearalenon 1mg 0,139 1,3 Bisphenol A 0,05mg 0,098 0,005
Kết quả hoạt tính estrogen trong bảng 4-14 được tính toán theo phương pháp nấm men tái tổ hợp. Phương pháp này thường được sử dụng trong việc tính toán tác dụng estrogen của hooc môn môi trường nên sau đây xin được giải thích sơ lược về phương pháp này.
Đây là phương pháp sử dụng tế bào nấm men biến đổi gen để xác định nồng độ các chất có tác dụng estrogen. Người ta cấy gen quy định tổng hợp Beta-galactocidase vào một plasmit (nhiễm sắc thể vòng của nấm men và VK) sau đó cấy vào tế bào nấm men. Việc tiếp thể estrogen và các chất có tác dụng estrogen kết hợp với nhau, sẽđồng thời kích hoạt sự tổng hợp beta-galatocidase, enzim này sẽ có tác dụng làm đổi màu chất thử hoạt tính từ màu vàng sang màu đỏ, dựa vào phổ màu đặc trưng của mỗi phản ứng mà người ta xác định nồng độ chất có tác dụng estrogen.
Đầu tiên, nhờ vào sự kết hợp của estrogen, gen di truyền (ERE) có thể kết hợp những tiếp thể estrogen hoạt tính hóa, liên kết cùng với enzim(tham khảo hình 4-15). Hơn nữa, khi những tiếp thể hoạt tính hóa kết hợp với gen di truyền (ERE) thì xuất hiện gen di truyền khác với gen ERE, được gọi là phần vận chuyển, đồng thời kích hoạt sự tổng hợp enzim β-galactosidase. Kết quả là, nếu hooc môn môi trường kết hợp với tiếp thể thì galactosidase được tổng hợp.Vì thế nhờ vào việc tính toán enzim hoạt tính hóa này ta có thể biết được mức độ kết hợp của hooc môn môi trường với các tiếp thể. Bảng 4-16 so sánh độ chính xác của phương pháp nấm men tái tổ hợp với phương pháp MCF-7( sẽ trình bày sau) và phương pháp tính trọng lượng tử cung. Phương pháp nấm men tái tổ hợp có độ chính xác tương đối cao.
Hình 4-15 Nguyên lý tính toán lượng estrogen nhờ phương pháp nấm men tai tổ hợp (Nhóm Routledge,1996) Bảng 4-16 So sánh đặc trưng của 3 phương pháp tính estrogen hoạt tính (Nhóm Coldham, 1997)
Tính năng Phương pháp enzim Phương pháp MCF-7 Phương pháp trọng lượng tử cung chuột Độ cảm thụ estradiol 0,1pM 1pM 18pM
Tiếp thể hooc môn người người chuột
Đích của thí nghiệm Galactosidase Sự tăng trưởng tế
bào trọng lượng tử cung
Thời gian thí nghiệm giờ Ngày Ngày
Tự động hóa Có thể Có thể Không thể
• Bisphenol A
Bisphenol A là nguyên liệu tổng hợpnên plastic polycarbonat và dầu nhựa epoxy. 70 % lượng sản xuất bisphenol A là dùng cho polycarbonat và 25% là được sử dụng trong nhựa epoxy . Từ công thức phản ứng các chất này ( hình 4-17), ta thấy bisphenol A là những mắt xích phân tử dài trong chuỗi cao phân tử .
hình 4-17 Phản ứng tổng hợppolycarbonate và nhựa epoxy
Khi tổng hợpcác chuỗi cao phân tử từ các phân tử lượng thấp thì thế nào cũng có một lượng nhỏ nguyên liệu phân tử lượng thấp sẽ không tham gia trong chuỗi mắt xích cao phân tử mà lưu tồn trong hợp chất cao phân tử .
Khởi nguồn của vấn đề bisphenol A tan ra, theo cuốn sách Our Stolen Future, là khi các nhà nghiên cứu tế bào đã sử dụng ống thí nghiệm bằng nhựa polycarbonat để nuôi cấy tế bào. Và các nhà khoa học này đã sử dụng hai loại dung dịch để nuôi cấy tế bào tiền ung thư vú và đặt tên cho phương pháp này là MCF-7. Một ống nghiệm là dung dịch trong ống thủy tinh và qua xử lý nhiệt độ cao, ống nghiệm kia là dung dịch trong ống nghiệm bằng polycarbonat và qua xử lý nhiệt từ 120 –125 độ trong 30 phút.
Sau 6-8 ngày nuôi cấy tế bào, các nhà nghiên cứu đã tính toán lượng tiếp thể hooc môn progesteron (một loại hooc môn phụ nữ) xuất hiện. Và kết quả trung bình của 3 lần tính toán được biểu thị ở bảng 4-18. Mặc dù ít nhưng khi dùng dung dịch qua xử lý nhiệt bằng ống nghiệm polycarbonat có lượng tiếp thể progesteron xuất hiện nhiều hơn.
Bảng 4-18 So sánh lượng xuất hiện tiếp thể progesteron trong phương pháp MCF-7 giữa thủy tinh và ống nhựa polycarbonate ( Nhóm Krishnan, 1993)
Lượng tiếp thể progesteron (fmol/mg) Số thứ tự
Thủy tinh Polycarbonat
1 28 42 2 20 34 2 20 34 3 18 26 Tiếp thể xuất hiện có nghĩa là có chất nào đó tác dụng với tiếp thể đó theo như sự chỉ đạo tổng hợp enzim P450. Các nhà nghiên cứu đã tinh lọc các chất tan ra từ polycarbonat bằng phương pháp sắc ký, sau đó bằng máy cộng hưởng lực từ hạt nhân(nuclear magnetic resonance) và phân tích lượng chất, đã đi đến kết luận nguyên nhân là do bisphenol A
Hơn nữa, Khi dùng bisphenol A được lưu hành trên thị trường để thí nghiệm theo phương pháp MCF-7, so sánh lượng tiếp thể progesterol xuất hiện với trường hợp estradiol thì có được kết quả như hình 4-19. Mặc dù cần một nồng độ gấp 1000 lần so với estradiol nhưng bisphenol A cũng thể hiện có tác dụng estrogen.
Hình 4-19 Sự dẫn xuất tiếp thể progesteron do chất bisphenol A và estradiol theo phương pháp MCF-7 (Nhóm Krishnan,1993)
Trong lúc mang thai nếu bị nhiễm bisphenol A thì con chuột đực khi trưởng thành có trọng lượng tuyến tiền liệt tăng. Người ta nói là nếu nồng độ bisphenol A thấp hơn 50mg/kg trọng lượng cơ thể mỗi ngày thì thì không có biểu hiện độc tính nhưng khi thí nghiệm ảnh hưởng của bisphenol A đối với tuyến sữa của chuột ở nồng độ thấp hơn nồng độ trên thì các tế bào tuyến sữa đã gia tăng như hình 4-20.
Hình 4-20 Sự tăng trưởng tế bào sau khi tiêm bisphenol A trong 11 ngày của thời kỳ hình thành DNA tế bào tuyến sữa của chuột (Nhóm Colerangle,1997)
* chưa vẽ*
Bisphenol A cũng được sử dụng làm nguyên liệu chất hàn răng sâu. Trước những lo lắng của xã hội về ảnh hưởng của bisphenol A, Liên đoàn bao bì, đồ đựng và độc tố của bộ Y tế đã trả đưa ra kết luận là lượng tan chất bisphenol A là rất ít nên việc sử dụng các đồ đựng bằng nhựa sẽ gây tác hại đối với sức khỏe là điều không thể có được. Mặc dù không có những ảnh hưởng xấu có thể nhìn bằng mắt ngay được, nhưng chất bisphenol A (chất có tác dụng hooc môn estrogen dù là tác dụng yếu) đang tan ra là một sự thật. Vì vậy chúng ta phải nghiên cứu rõ những ảnh hưởng của bisphenol A trong một thời gian dài đối với con người, đặc biệt là đối với thai nhi và trẻ em trong thời kỳ bú sữa.
Ở Nhật, luật vệ sinh an toàn thực phẩm có quy định nồng độ tiếp xúc cho phép của bisphenol A là 2.5ppm. Nồng độ đó dựa vào kết quả thí nghiệm trong một thời gian dài đối với chuột, nồng độ hấp thụ thấp nhất có biểu hiện độc tính là 50mg/ kg trọng lượng cơ thể trong 1 ngày. Và để có được hệ số an toàn thì nhân với tỉ lệ 1/1000 thì được nồng độ hấp thụ cho phép trong 1 ngày là 0.05mg/kg trọng lượng cơ thể. Coi trọng lượng 1 người Nhật khoảng 50kg, và lượng nhựa tiếp xúc là 1 kg thì có công thức như sau và có giá trị tiêu chuẩn là 2,5ppm.
0,05mg/kg x50kg x 1/1kg =2.5ppm.
• Chất làm mềm nhựa
Chất nhựa cứng PVC được sử dụng ở những đường ống dẫn nước, viền nhựa cửa sổ. Nhưng nếu thêm chất diethylhexyl phthalate (DEHP) với tỉ lệ khoảng gần 50% vào nhựa cứng thì được một nguyên liệu mềm. Chất này trong, chịu lực tốt, giá rẻ nên thường được sử dụng làm vỏ đường dẫn điện, ống dẫn nước, đồ chơi, túi truyền máu…
Những chất phụ gia như DEHP gọi là chất làm mềm, nhựa có chất làm mềm được gọi là nhựa mềm. Hơn 80% các chất cao phân tử có phụ thêm chất làm mềm đều thuộc nhóm nhựa.
Chất làm mềm có khả năng kết hợp với các tiếp thể estrogen dù hơi yếu. Chất làm mềm có biểu hiện cưỡng chế khả năng kết hợp của estradiol đối với tiếp thể estrogen tồn tại trong gan cá hồi như hình 4-21. Khả năng kết hợp của estradiol bị hạn chế do các chất làm mềm, có nghĩa là chất làm mềm cũng kết hợp với các tiếp thể estrogen.
Hình 4-21 Kết quả cưỡng chế của chất làm mềm đối với sự kết hợp estradiol và tiếp thể estradiol của cá hồi (Nhóm Jobling,1995)
Khả năng cưỡng chế của DEHP là rất thấp nhưng chất phân giải thêm nước của DEHP là Mono 2-ethylhexyl phthalate (MEHP) có tác dụng estrogen lớn hơn DEHP. Chất phân giải thêm nước này cũng được tạo ra do cytochrom P450 trong gan.
Kết quả kiểm tra ảnh hưởng của chất làm mềm (benzylbutyl phthalte, Dibutyl phthale) đối với tử cung của chuột cái lúc dậy thì được miêu tả ở bảng 4-14. Ở thí nghiệm này, sau khi chất làm mềm được tiêm vào dưới da chuột 4 ngày thì tiêm tiếp thuốc chết an lạc cho chuột, sau đó tính toán trọng lượng tử cung. Bảng 4-14 cũng có kết quả ảnh hưởng của các chất hooc môn môi trường khác. Hơn nữa, ở đó cũng có kết quả so sánh khả năng kết hợp với tiếp thể estrogen dựa vào phương pháp nấm men tái tổ hợp.
Theo những nghiên cứu gần đây của Mỹ, khi tiêm vào cơ thể chuột mang thai chất Di n-butyl phthalate với lượng 250-750mg/kg trọng lượng cơ thể mỗi ngày thì chuột đực con sẽ bị hoặc mất hay teo nhỏ tinh hoàn, tuyến tiền liệt. Nhưng những biểu hiện rõ rệt ở chuột cái con thì không rõ ràng. Vì vậy có lẽ chất làm mềm có tác dụng kháng androgen hơn là tác dụng estrogen.
Hình 4-22 Cấu trúc hóa học của chất chống oxi hóa BHT
Nhựa có chất làm mềm là Diethylhexyl phthalate thường được sử dụng rộng rãi trong lĩnh vực y hoc như túi tiếp máu, dụng cụ truyền máu, các ống dẫn để trong cơ thể…. Những thử nghiệm tính an toàn của chất này đã được tiến hành vào những năm 1970 và kết luận chất làm mềm sử dụng trong dụng cụ y học là an toàn. Nhưng tại thời điểm đó chưa có những thử nghiệm độc tính đối với hệ sinh sản.
• Chất chống Oxy hóa
Nhiều chất chống oxy hóa được sử dụng làm chất phụ gia cho nhiều loại nhựa với tỉ lệ trung bình khoảng 0,2% để tránh hiện tượng oxy hóa trong lúc gia công định hình ở nhiệt độ cao. Chất chống oxy hóa điển hình là BHT (butylhydroxytoluene) có cấu trúc hóa học như ở hình 4-22.
Chất nonilphenol có trong polystyrene có tác dụng estrogen như đã giới thiệu ở chương1. Bảng 4-23 giới thiệu kết quả điều tra ảnh hưởng của chất chống oxy hóa phenilphenol với sự gia tăng tế bào theo phương pháp MCF-7. Ở bảng này cũng có kết quả của các chất như bisphenol A, benzylbutyl phthalate, DDT…Nồng độ nhỏ nhất trong bảng là nồng độ nhỏ nhất của các chất hooc môn môi trường làm cho tế bào gia tăng mạnh nhất, số tế bào gia tăng mạnh nhất là giá trị tương dương khi estradiol đạt được là 100. Bất kỳ chất nào cũng có làm cho tế bào gia tăng nên ít nhiều đều có biểu hiện estrogen.
Bảng 4-23 So sánh hoạt tính estrogen của các chất (Coi tác dụng của estradiol=100) (Soto,1997) Tên chất hóa học Nồng độ nhỏ nhất Số tế bào tăng trưởng lớn nhất.
Estradiol 0,0001mM 100 p-phenilphenol 10mM 88 m-phenilphenol 50mM 60 o-phenilphenol 100mM 30 Benzylbutyl phthalate 10mM 90 Bisphenol A 1mM 82 2,2’,3,3’,6,6’-HCB 10mM 62 P,p’-DDT 10mM 71 P,p’-DDE 10mM 25 • Styrene
Bọt xốp theo như hình 4-24 được tổng hợpnhờ nhiều phân tử styrene kết nối lại. Styrenemonomer (đơn phân tử styrene) còn tồn tại trong polystyrene khoảng từ 0,01-0,1%. Chính vì vậy, nếu rót nước sôi vào bọt xốp thì khoảng vài chục ppb styrenemonomer tan ra. Chất phụ sinh monomer có 2 hoặc 3 phân tử thì có cấu trúc hóa học là dimer hoặc trimer, rất phong phú. Tính tan trong nước các chất này kém. Ở 100 độ C, nếu không cho thêm hoặc chất tẩy mạnh, hoặc dầu, hoặc cồn cùng nước sôi, thì lượng tan ra là rất ít.