CHƢƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.2.5.2. Xácđịnh trình tự 28S rARN nhóm nấm mốc đại diện
Nguyên tắc: Giải trình tự gene 28S rARN và tra cứu trên Blast search để xác định loài nấm mốc.
K16 32Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật
Phương pháp tiến hành: Tách chiết DNA tổng số của nấm mốc theo protocol của Sambrook và Russell (2001) và nhân đoạn gene mã hóa 28S rARN bằng kỹ thuật PCR. Tách chiết DNA tổng số của nấm sợi: DNA tổng số nấm mốc được tách chiết dựa trên phương pháp tách chiết bằng kiềm (alkaline extraction). 100 mg sợi nấm đã được rửa sạch, thu từ môi trường nuôi lỏng, được trộn kỹ với 600µl đệm TENS (10mM Tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA; 1N NaOH và 0,5 % SDS) trong ống Eppendorf 1,5 ml và ủ ở 55 oC trong 15 phút. Sau khi ủ, đá thủy tinh được thêm vào để phá vỡ thành tế bào nấm bằng cách vortex bốn lần một phút với thời gian nghỉ 1 phút trong đá lạnh giữa các lần. Đá thủy tinh được loại bỏ bằng ly tâm. Sau đó, chloroform được thêm vào dịch phá tế bào ở trên với tỉ lệ 1:1, để ở nhiệt độ phòng 5 phút. Hỗn hợp trên được ly tâm 12.500 vòng/phút trong 15 phút ở 4 ºC, dịch nổi được hút vào ống Eppendorf 1,5 ml mới. Tiếp theo, iso - propanol lạnh được thêm vào với tỷ lệ 1: 1, ly tâm với tốc độ 15.000 vòng/phút trong 30 phút ở 4 ºC, và loại bỏ dịch nổi. Sau đó, kết tủa DNA được rửa 2 ÷ 3 lần bằng 500 µl etanol 70% trước khi được hòa trong 50µl đệm TE. Chất lượng DNA được kiểm tra bằng điện di trên gel agaroza 0,8 % (Sambrook và Russell, 2011)
Quy trình PCR: Quy trình PCR được thực hiện với tổng thể tích 25µl chứa 1µl DNA khuôn; 2,5 µl đệm PCR 10x (100 mM Tris-HCl pH 8; 500 mM KCl; 25 mM MgCl2); 0,5 µl mồi; 1 U Taq polymeraza, và chu trình nhiệt: 95 ºC trong 5 phút (1), 94 ºC trong 30 giây (2), 52 ÷ 56 ºC trong 1 phút 30 giây (3), 72 ºC trong 1 phút 30 giây (4) và 35 chu kỳ lặp lại từ (2) ÷ (4); (5) 72 ºC trong 5 phút và sau đó giữ lạnh ở 4 ºC. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agaroza 2,5%.Xác định trình tự đoạn gen mã hóa 28S rARN theo phương pháp của Sanger, sử dụng máy đọc trình tự tự động ABI PRISM 3100 Avant Data Collection v1.0 và Sequence Analysis [4]. Trình tự của đoạn gene mã hóa 28S rARN của mẫu được so sánh với các đoạn gene mã hóa 28S rRNA đã được công bố trên Blast Search. Sử dụng phần mềm Clustal X, Bioedit để phân loại chủng nấm mốc. Số liệu được tính giá trị trung bình và phân tích ANA (Duncans test p<0,05) bằng chương trình SAS [5].
K16 33Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật