3. Nội dung nghiên cứu
2.2.5. Điện di hai chiều 2DE
Kỹ thuật điện di hai chiều là sự kết hợp của hai nguyên lý phân tách khác nhau. Theo chiều thứ nhất các phân tử protein được phân tách dựa theo điểm đẳng điện pI trên một thanh cố đinh gradient pH. Chiều thứ hai các phân tử protein được phân tách trên điện di trên gel polyacrylamid (như điện di SDS - PAGE).
Điện di chiều 1 được thực hiện trên máy điện di đẳng điện PROTEAN IEF với thanh cố dịnh gradient pH( ReadyStrip IPG strip); 7cm, pH 3-10 của Bio- Rad( Bio- Rad, Hercules,CA,Mỹ). Gel 2-D được chụp, phân tích và so sánh hình ảnh với sự hỗ trợ của phần mềm Progenesis Samepotrs (Nonlinear Dynamics, Anh).
Điện di chiều thứ nhất (điện di đẳng điện)
110µg protein lá mẫu lá ĐT12 ở thời điểm 9 ngày sau nhiễm bệnh hòa trong 120µl đệm mẫu (9M Urea, 2% CHAPS, 50mM DTT, 0,2% (w/v) Bioampholyte 3/10 và Bromophenol Blue). Các thanh được đúc sẵn tạo giải pH chính xác và thuận tiện khi sử dụng. Mẫu được thấm qua đêm vào các thanh cố định gradient pH 3-10, dài 7cm. Sau đó, các thanh này được tiến hành điện di chiều một trên hệ PROTEAN IEF (Bio-Rad) theo chương trình hiệu điện thế: (i) 250V trong 30 phút; (ii) 4000V trong 3 giờ; (iii) 4000V sao cho VHOUR cuối cùng đạt 11000V.
Cân bằng
Sau quá trình điện di đẳng điện, protein trên gel được cân bằng trong dung dịch có chứa (6M Urea, 2%SDS, Tris HCl pH8.8 0,375 M, glycerone 20%, DTT 2%) và dung dịch chứa ( 6M Urea, 2%SDS, Tris HCl pH8.8 0,375 M, glycerone 20%, Iodoacetamide 0,5 g/20ml cho vào trước khi cân bằng)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 34 http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Điện di chiều hai
Protein trong thanh pH 3-10 sau khi điện di chiều thứ nhất và cân bằng được tiến hành chiều thứ hai (SDS-PAGE) trên gel polyacrylamide 12,5% với điện thế 80V trong 10 phút, 120V trong 30 phút và 150V trong 2 giờ.
Thí nghiệm điện di 2 chiều được lặp lại 3 lần.