3. Nội dung nghiên cứu
1.6.1. Các nguyên tố đất hiếm
Đất hiếm, theo IUPAC là tập hợp của mười bảy nguyên tố hóa học trong bảng tuần hoàn Mendeleev (hình 1.4). Là nhóm nguyên tố hiếm có hàm lượng ít trong vỏ Trái đất và rất khó tách ra từng nguyên tố riêng biệt, 17 nguyên tố chia làm hai nhóm [89]:
+ Nhóm nặng gồm 10 nguyên tố: Dysprosium (Dy), Erbium (Er), Europium (Eu), Gadolinium (Gd), Holmium (Ho), Lutetium(Lu). Terbium (Tb), Thulium (Tm), Ytterbium (Yb), Yttrium (Y).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 20 http://www.lrc-tnu.edu.vn/
+ Nhóm nhẹ gồm 07 nguyên tố: Cerium (Ce), Lathanium (La), Neodymium(Nd), Praseodymium (Pr), Promethium (Pm), Samarium (Sm) và Scandium (Sc).
- Vỏ Trái đất chứa 0,0015 - 0,0020% R2O3. - Cây cối chứa trung bình 0,0003% R2O3.
Các nguyên tố đất hiếm đã được nghiên cứu và sử dụng nhiều ở các nước như Trung Quốc, Nhật Bản, Úc, Brazil ...
Hình 1.4. Bảng phân bố các nguyên tố 1.6.2. Tác động của đất hiếm đối với cây trồng
Nghiên cứu của nhiều tác giả cho thấy, đất hiếm có tác dụng làm tăng khả năng phát triển bộ rễ, tăng tính chống hạn, kháng bệnh, tăng khả năng hấp thu dinh dưỡng, kích thích sự tăng trưởng và phát triển, tăng năng suất cây trồng. Ứng dụng của đất hiếm trong sản xuất nông nghiệp đã được phát triển ở Trung Quốc từ những năm 80. Một thời gian ngắn sau khi ứng dụng, tác dụng của đất hiếm đối với cây trồng đã được phát huy mạnh mẽ ở nhiều nước trên thế giới[23], [67], [81].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 21 http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Tuy nhiên, đất hiếm không gây sức tác động tích cực đối với cây trồng trong mọi trường hợp, sử dụng với liều cao sẽ thể hiện sự bất lợi, thậm chí dẫn đến độc hại cho cây và cho đất trồng. Với các loài thực vật khác nhau thì sử dụng đất hiếm với liều lượng khác nhau (bảng 1.1).
Bảng 1.1. Phương pháp và nồng độ đất hiếm đối với một số cây trồng [32] Cây trồng PP thực hiện Liều lƣợng Giai đoạn áp dụng Lúa mỳ Ngô Khoai tây Cải dầu Cây gai Cây lanh Táo gai Chuối Phun Trộn hạt Ngâm hạt Giống Trộn hạt Trộn hạt Phun Trộn hạt Phun Phun 600mg/l 3g/kg 8g/1kg 6g/1kg 5g/1kg 100-300mg/l 600 g/ha „‟ 400 mg/l 300 - 500 mg/l
GĐ sinh trưởng sinh thực Trước khi gieo
- Trước khi gieo - Gđ cây con - Gđ nụ Gđ hoa
Gđ cây con và quả bé
Liều khuyến cáo bón trong đất an toàn cho cây hấp phụ là: < 1 g oxit đất hiếm/1kg đất. Ở những ngưỡng nồng độ nhất định cây trồng đều thể hiện phản ứng cả sinh lý, sinh hóa cả năng suất và khả năng kháng lại các tác nhân gây hại [81].
1.6.2.1. Phản ứng đối với năng suất
Cây trồng có thể tăng năng suất từ 5 - 20% (bảng 1.2) bao gồm tăng chất khô và tươi trong các loại cây trồng như lúa mỳ, ngô và lúa..., tăng hàm lượng đường trong mía, củ cải đường..., tăng hàm lượng tinh bột trong khoai tây...,tăng hàm lượng vitamin C trong nho và táo và tăng hàm lượng chất béo và protein trong đậu tương [65], [82].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 22 http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Bảng 1.2. Ứng dụng phân bón vi lƣợng đất hiếm
Cây trồng Mức tăng
năng suất (%) Cây trồng
Mức tăng năng suất (%) Táo Lúa Nho Ngô Bông Chuối Đậu tƣơng Cà chua Cam Hạt tiêu Thuốc lá 10 -15 5-10 8-12 6-11 7-10 8-15 5-10 10-15 5-10 8-15 10 Dưa chuột Mía Cao su Bắp cải Lúa mì Chè Củ cải đường Dưa hấu Lạc Nhãn 8-15 10-15 8-14 10-20 6-12 8-12 6-12 8-10 8-12 10-20
1.6.2.2. Các phản ứng sinh lý, sinh hóa trong cây
Cây thể hiện lá màu xanh đậm do nồng độ chất diệp lục cao hơn, tỷ lệ tăng trưởng phát triển cao hơn và sức đẻ nhánh mạnh hơn. Thay đổi hoạt động và hàm lượng của một số enzyme thực vật đã quan sát thấy trong cây trồng khi được xử lý đất hiếm. Việc tăng đáng kể hàm lượng của glucoza và fructoza trong củ cải đường sau khi ứng dụng phân bón lá đất hiếm, được coi là lời giải thích cho tác dụng của đất hiếm trên cây trồng. Tác dụng của đất hiếm thể hiện mối tương quan chặt (hệ số tương quan 0.922) giữa tích lũy đất hiếm và hoạt động của enzyme transaminase glutamic oxaloacetic (GOT) [85] trong cây. Trong cây trồng, GOT kích hoạt các phản ứng α - ketoglutarate + L-aspartic axit → L-glutamate axit + axit oxaloacetic, trong đó bao gồm cả nitơ và chuyển hóa acid amin và có thể thay đổi chức năng các cơ quan.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 23 http://www.lrc-tnu.edu.vn/
- Các nghiên cứu khác đã chứng minh rằng deoxidase nitrat trong lá đậu tương tăng khi sử dụng đất hiếm xử lý hạt giống, hoặc ở giai đoạn hoa đầu tiên xuất hiện [83].
- Khi sử dụng nguyên tố đất hiếm như phân bón, sự hấp thụ của cây lúa đối với N, P, K và tăng tương ứng 16,4%, 12% và 8,5% . Các kết quả cũng cho thấy một quá trình di chuyển của REs từ rễ cây lên lá khi bón cho đất hoặc từ lá đến rễ khi phun lên lá. Sự tích lũy của nguyên tố đất hiếm trong các phần khác nhau của cây trồng theo thứ tự : Rễ > lá > thân> hạt, nồng độ của nguyên tố đất hiếm trong rễ , lá và thân cây tăng lên rõ rệt. Tuy nhiên, không có tích lũy đáng kể đã được quan sát thấy trong các loại hạt ngũ cốc [24].
- Nguyên tố đất hiếm có thể làm tăng hoạt động của hệ thống quang II trong cây và liên kết với chất diệp lục của nó. La3 + tăng tốc các phản ứng quang hợp ở nồng độ thích hợp trong cây [40].
1.6.2.3. Phản ứng đối với tác nhân gây hại
- Việc áp dụng các nguyên tố đất hiếm để ngăn ngừa bệnh mềm thối bắp cải đã được cấp bằng sáng chế ở Nhật Bản từ năm 1980 (Kawasaki, 1980).
- Tác động của nguyên tố đất hiếm trong cây ngô (Zea mays L) cho thấy nguyên tố đất hiếm có thể tăng hoạt động POD và SOD (peroxidase và superoxide dismutase), hàm lượng sinh hóa và có tác động đến sản lượng và khả năng chống áp lực đối với cây ngô [23].
- Khi cây hấp thu quá nhiều nguyên tố đất hiếm trong đất, một cơ chế quy định cân bằng bên trong cây được xuất hiện để điều chỉnh nồng độ REs trong cây [81].
- Theo Kataoka và cộng sự, nguyên tố đất hiếm khác nhau có hiệu lực khác nhau, erbium và ytterbium cho hiệu quả rất rõ đối với việc kích thích các protein malate trong rễ lúa mì. Đây được coi là cơ chế chính cho khả năng chịu nhôm trong lúa mì vì nó được giả định rằng các anion hữu cơ đã
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 24 http://www.lrc-tnu.edu.vn/
phức hóa các cation nhôm trong vùng rễ để tạo thành phức hợp không độc hại. Bằng cách kích hoạt protein malate, đất hiếm có thể hỗ trợ cây trồng để khắc phục ngộ độc nhôm [47].
- Giảm áp lực của môi trường gồm hạn hán và lạnh, cũng như mưa axit hoặc áp lực kim loại di động có thể được giải thích khi quan sát thấy trong cây trồng sau khi xử lý đất hiếm. Rõ ràng rằng khi lanthanum được áp dụng cho cây lúa mạch trong điều kiện nước tưới bị hạn chế [53], [55] cây trồng này vẫn duy trì được tốc độ tăng trưởng.
- Trong các nghiên cứu nuôi cấy tinh khiết, người ta thấy rằng một số vi khuẩn gây bệnh thực vật cũng như hoạt động của một số enzyme liên quan đến bệnh học có thể bị kiểm soát bởi các nguyên tố đất hiếm [74]. Điều này cho thấy đất hiếm có thể bảo vệ thực vật khỏi vi sinh vật gây bệnh.
- Ở nồng độ 83-100 μ mol / l LaCl3 cho thấy hạn chế 50% trứng nở của Globodera rostochiensis, một loài tuyến trùng ký sinh, có thể làm tổn thương rễ của khoai tây [18]. Lanthanum được cho là đã cản trở sự liên kết và hoạt động của các phân tử exsudat trong rễ của cây khoai tây chủ, đó là chất cần thiết để kích thích trứng nở. Đất hiếm được sử dụng làm miếng dán [78] dán vào vỏ cây cao su giúp kiểm soát tỷ lệ mắc bệnh xơ libe màu nâu.
1.6.3. Nghiên cứu ứng dụng đất hiếm đối với cây trồng ở Việt Nam
Tại Việt Nam đất hiếm đã được thử nghiệm trên một số cây trồng như: Cây chè, dâu tằm, ngô, lúa và một số loại rau ăn lá cả ở các tỉnh phía bắc và phía nam đều cho kết quả khá tốt.
Kết quả khảo nghiệm phân bón vi lượng đất hiếm trên cây chè (tại Viện Nghiên cứu Chè Phú Hộ - Phú Thọ, công ty chè Sông Lô, Công ty chè Phú Bền và một số hộ trồng chè thuộc huyện Phổ Yên tỉnh Thái Nguyên) từ năm 2004 đến 2007 cho thấy:
Đối với chè kinh doanh : Độ dày tán chè, mật độ búp chè, năng suất chè có tỷ lệ tăng trung bình tương ứng là 15,75%, 21,6% , 15,04% và giảm
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 25 http://www.lrc-tnu.edu.vn/
tỷ lệ mù xoè so với đối chứng. Rút ngắn thời gian giữa 2 lứa hái từ 2 - 3 ngày tỷ lệ búp loại A cao hơn. Hàm lượng đường khử trong búp chè cao, có lợi cho chế biến; các thành phần dinh dưỡng trong búp chè cân đối, chất lượng chè tăng rõ nhất là những biểu hiện cảm quan: Cánh bóng xoăn đều, màu nước xanh sáng hơn so với không sử dụng phân vi lượng đất hiếm. Tăng hương vị của chè, giảm độ đắng và giảm hệ số K khi chế biến.
Đối với chè vườn ươm: Tăng chiều cao cây, đường kính thân, số lá trên cây chè con; tăng khối lượng thân, lá và nhất là sinh khối rễ tăng trung bình 33,8% so đối chứng, giúp chè con khoẻ khi trồng mới. Phân bón vi lượng đất hiếm cũng được áp dụng đối với cây lúa, ngô, dâu tằm (tại Phổ Yên- Tuyên Quang) và rau ăn lá (tại Củ Chi, TP Hồ Chí Minh) đếu cho những kết quả khả quan.
Đối với cây ngô vụ đông (2004) năng suất có khả năng cho tăng từ 10 - 15% tăng khả năng chịu hạn và bệnh khô vằn ít hơn.
Đối với cây lúa: Làm tăng khả năng đẻ nhánh, cây lúa sinh trưởng và phát triển tốt hơn, có thời gian trỗ tập trung hơn nên hạn chế được sâu đục thân.
Đối với cây dâu tằm năng suất lá tăng 43% so với đối chứng, chất lượng tốt, tằm ăn khoẻ, năng suất kén tăng
Đối với rau ăn lá: giữa các công thức sử dụng đất hiếm tỷ lệ chênh lệch không đáng kể. So với đối chứng năng suất ớ các công thức sử dụng đất hiếm tăng từ 39 - 49%. Như vậy đối với điều kiện đất xám bạc màu như Củ Chi Thành phố Hồ Chí Minh đất hiếm có tác dụng rất rõ.
Ở Việt Nam, hiện tại các nguyên tố đất hiếm đã được khai thác sử dụng như là một yếu tố bổ sung dinh dưỡng thúc đẩy tăng trưởng và tăng năng suất cây trồng. Ở một khía cạnh nào đó đất hiếm cũng đã được nhìn nhận có khả năng làm tăng tính kháng của cây.
Nghiên cứu ứng dụng đất hiếm kích thích tính kháng bệnh của cây trồng nói chung, cũng như đối với cây đậu tương là một vấn đề còn mới
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 26 http://www.lrc-tnu.edu.vn/
mẻ. Trong những năm gần đây, các nghiên cứu về bệnh gỉ sắt ở đậu tương đã được tiến hành và thu được một số kết quả đáng kể. Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu trên đều tập trung vào gen, nghiên cứu lập bản đồ gen kháng, đánh giá sự tổn thất năng suất, nghiên cứu dịch tễ học, đánh giá quá trình phát triển hoặc nguy cơ phát triển bệnh, cũng như đánh giá tuyển chọn các giống đậu tương có tính kháng bệnh. Các nghiên cứu chưa đi sâu vào nghiên cứu thành phần hóa sinh, sự đa dạng di truyền trong cấu trúc gen và kích thích tính kháng thông qua hệ protein được coi là khá bảo thủ của cây đậu tương.
1.7. Protein ở lá cây đậu tƣơng
1.7.1. Thành phần protein ở lá cây đậu tương
Chức năng chính của lá là thu nhận quang năng, chuyển hóa chúng và dữ trữ dưới dạng các liên kết hóa học. Do đó, có một số lượng lớn các protein của lá đậu tương là các protein liên quan đến quá trình trao đổi chất và năng lượng. Các protein lá đậu tương có liên quan đến quá trình vận chuyển điện tử như reaction centre subunit, PSII oxygen-evolving complex protein, carbonic anhydrase, ferrodoxin. Các enzyme liên quan đến quá trình trao đổi và chuyển hóa carbon như rubisco, malate dehydrogenase, sedoheptulose-1,7-biphosphatase, phosphoglycerate kinase, glyceraldehyde- 3-phosphate dehydrogenase, triosephosphate isomerase. Rubisco là enzyme chính có vai trò rất quan trọng trong quá trình cố định carbon. Hệ protein lá đậu tương còn có các protein dự trữ như vegetative storage protein [17], stem 28 kDa protein, cyclophilin,các protein có liên quan đến các quá trình trao đổi và chuyển hóa của các amino acid hoặc các protein liên quan đến tính kháng bệnh, chống chịu stress như ascorbate peroxidase, catalase.
1.7.2. Những nghiên cứu protenin ở lá đậu tương
Việc nghiên cứu và lập bản đồ điện di hệ protein cũng như xác định các protein lá của đậu tương đã được tiến hành trong những năm gần đây
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 27 http://www.lrc-tnu.edu.vn/
[50], [63], [84]. Bước đầu đã có một số công bố tiến hành phân tích hệ protein lá đậu tương kháng bệnh gỉ sắt cũng như lập bản đồ điện di hệ protein lá và định danh chúng để làm căn cứ so sánh, nghiên cứu các protein liên quan đến bệnh lý.
Kết quả “Nghiên cứu thành phần Protein lá đậu tương nhiễm bệnh gỉ sắt bằng phương pháp điện di 1 chiều” [9] - điện di biến tính trên gel polyacylamide (SDS - PAGE) của proein tổng số, đối với lá các giống đậu tương sau khi nhiễm bệnh gỉ sắt cho thấy, mẫu protein lá đều bị phân hủy tạo thành vệt dài trên điện di; mẫu lá nhiễm bệnh sau 7 ngày phát hiện thấy 19- 21 băng, trong đó có những protein chính của lá như rubisco tiểu phần lớn và tiểu phần nhỏ, chưa phát hiện được sự thay đổi rõ rệt giữa giống kháng và giống nhiễm cũng như đối chứng không nhiễm bệnh. Phương pháp sử dụng TCA và aceton cho kết quả phát hiện được trên 110 vệt protein trên lá không nhiễm bệnh.
Cho đến nay, các nghiên cứu về protein lá đậu tương còn rất hạn chế. Các kết quả trên mới chỉ là những bước khởi đầu, tạo tiền đề cho việc nghiên cứu sự biểu hiện khác nhau của các protein trong môi trường bất lợi, hoặc trong các điều kiện kháng vi sinh vật gây hại và sâu bệnh. Điều này có vai trò rất quan trọng trong nghiên cứu chức năng của các protein có liên quan đến tính kháng bệnh của cây đậu tương, nhằm cải thiện chất lượng và năng suất đậu tương. Để tiếp thu và phát huy những kỹ thuật khoa học đang được ứng dụng rộng rãi cho nghiên cứu protein của cây đậu tương, đặc biệt là ở lá. Chúng tôi sử dụng cây đậu tương ĐT12 mẫn cảm với bệnh gỉ sắt, sử dụng phức đất hiếm “Thủy tiên” xử lý hạt trước khi gieo và phun lên lá sau khi cây đậu tương được phun nhiễm bệnh gỉ sắt nhân tạo ở giai đoạn có hai lá kép để phục vụ cho nghiên cứu. Sử dụng phương pháp điện di hai chiều để phân tích những biến đổi protein trong lá đậu tương nhiễm bệnh khi được xử lý phức đất hiếm, nhằm đánh giá phản ứng của cây đậu tương cũng như phân tích sự khác biệt về thành phần điện di protein trong lá đậu tương nhiễm bệnh và không nhiễm bệnh.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 28 http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Chƣơng 2
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu
2.1.1. Vật liệu và phương pháp thu thập lá bệnh
Đề tài đã sử dụng giống đậu tương ĐT12 do Viện Bảo Vệ Thực (VBVTV) vật cung cấp