3. Nội dung nghiên cứu
1.7.2. Những nghiên cứu proteni nở lá đậu tương
Việc nghiên cứu và lập bản đồ điện di hệ protein cũng như xác định các protein lá của đậu tương đã được tiến hành trong những năm gần đây
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 27 http://www.lrc-tnu.edu.vn/
[50], [63], [84]. Bước đầu đã có một số công bố tiến hành phân tích hệ protein lá đậu tương kháng bệnh gỉ sắt cũng như lập bản đồ điện di hệ protein lá và định danh chúng để làm căn cứ so sánh, nghiên cứu các protein liên quan đến bệnh lý.
Kết quả “Nghiên cứu thành phần Protein lá đậu tương nhiễm bệnh gỉ sắt bằng phương pháp điện di 1 chiều” [9] - điện di biến tính trên gel polyacylamide (SDS - PAGE) của proein tổng số, đối với lá các giống đậu tương sau khi nhiễm bệnh gỉ sắt cho thấy, mẫu protein lá đều bị phân hủy tạo thành vệt dài trên điện di; mẫu lá nhiễm bệnh sau 7 ngày phát hiện thấy 19- 21 băng, trong đó có những protein chính của lá như rubisco tiểu phần lớn và tiểu phần nhỏ, chưa phát hiện được sự thay đổi rõ rệt giữa giống kháng và giống nhiễm cũng như đối chứng không nhiễm bệnh. Phương pháp sử dụng TCA và aceton cho kết quả phát hiện được trên 110 vệt protein trên lá không nhiễm bệnh.
Cho đến nay, các nghiên cứu về protein lá đậu tương còn rất hạn chế. Các kết quả trên mới chỉ là những bước khởi đầu, tạo tiền đề cho việc nghiên cứu sự biểu hiện khác nhau của các protein trong môi trường bất lợi, hoặc trong các điều kiện kháng vi sinh vật gây hại và sâu bệnh. Điều này có vai trò rất quan trọng trong nghiên cứu chức năng của các protein có liên quan đến tính kháng bệnh của cây đậu tương, nhằm cải thiện chất lượng và năng suất đậu tương. Để tiếp thu và phát huy những kỹ thuật khoa học đang được ứng dụng rộng rãi cho nghiên cứu protein của cây đậu tương, đặc biệt là ở lá. Chúng tôi sử dụng cây đậu tương ĐT12 mẫn cảm với bệnh gỉ sắt, sử dụng phức đất hiếm “Thủy tiên” xử lý hạt trước khi gieo và phun lên lá sau khi cây đậu tương được phun nhiễm bệnh gỉ sắt nhân tạo ở giai đoạn có hai lá kép để phục vụ cho nghiên cứu. Sử dụng phương pháp điện di hai chiều để phân tích những biến đổi protein trong lá đậu tương nhiễm bệnh khi được xử lý phức đất hiếm, nhằm đánh giá phản ứng của cây đậu tương cũng như phân tích sự khác biệt về thành phần điện di protein trong lá đậu tương nhiễm bệnh và không nhiễm bệnh.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 28 http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Chƣơng 2
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu
2.1.1. Vật liệu và phương pháp thu thập lá bệnh
Đề tài đã sử dụng giống đậu tương ĐT12 do Viện Bảo Vệ Thực (VBVTV) vật cung cấp
Nguồn bệnh gỉ sắt:
Nguồn bệnh để lây nhiễm là bào tử của lá nhiễm bệnh được chuẩn bị trong nhà lưới của VBVTV.
Nguyên tắc thu thập lá bệnh: Chọn lá còn xanh, bị bệnh trên 50% diện tích lá, vết bệnh nổi gờ cao. Do nguồn bệnh hạn chế nên rửa trực tiếp lá bệnh trên cây nhằm duy trì nguồn bệnh.
Địa điểm thí ngiệm: tại nhà lưới của Viện Bảo Vệ Thực Vật, và phòng thí nghiệm của trường Đại học sư phạm Thái Nguyên
2.1.2. Hóa chất
Tất cả các hóa chất đều có độ tinh sạch cần thiết theo khuyến cáo của nhà sản xuất. Các hóa chất điện di SDS - PAGE, điện di 2DE, thuốc nhuộm Quick Start Bradford Dye Regent 1X được mua từ hãng Bio - Rad (Hercules, CA, Mỹ). Nitơ lỏng mua tại Việt Nam
Urea, CHAPs, DTT (Dithiothreitol), SDS, Tris HCl 8.8, glycerol, biosmpholyte 3/10, bioampholyte 5/7, bromophenol blue, iodoacetamide, coomassie G250, methanol, H3PO4, acrylamid/ Biss, APS, temed, TCA.
Aurum serum protein mini kit, 2-D Starter kit mua từ Bio-Rad (Hercules, CA, Mỹ) và coomassie brilliant blue R250 mua từ MP biomedicals (MP Biomedicals, Eschwege, Đức).
Phức đất hiếm “Thủy tiên” do viện Công Nghệ Xạ Hiếm cung cấp. Thành phàn cử “Thủy tiên” gồm:La:1,5%; Ce: 2,0%; các đất hiếm khác: 1,5%; Zn: 0,05%; Mn: 0,05%; chất hoạt hóa: 0,15%....
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 29 http://www.lrc-tnu.edu.vn/
2.1.3. Máy móc và thiết bị
Máy điện di protein SDS - PAGE của hàng Cleaver Scientific, Anh Hệ điện di 2 chiều 2-DE được thực hiện trên hệ điện di đẳng điện PROTEAN IEF mua từ Bio - Rad, Mỹ.
Máy chụp gel chuyên dụng Bio-5000 Plus của hãng Microtek, Đài Loan. Máy li tâm lạnh Hettich (Đức).
Máy ly tâm Eppendorf 5415C (Eppendorf, Đức). Máy khuấy trộn (Voltex) (Minishaker, IKA, Đức.
Lò vi sóng (SamSung, Hàn Quốc), tủ sấy của hãng Carbolite (Anh), tủ lạnh -200 (Sanyo, Nhật Bản), pipetman, giá đổ điện di, cối chày sứ, bể ổn nhiệt, nồi khử trùng…
2.2. Phƣơng pháp nhiên cứu
2.2.1. Phương pháp nhiễm bệnh nhân tạo và thu mẫu lá
Thí nghiệm được bố trí trong khu cách biệt của nhà lưới với 3 lần nhắc lại để đánh giá khả năng kháng bệnh của giống ĐT12 sau khi được xử lý bằng phức đất hiếm “Thủy tiên”. Mẫu đối chứng là mẫu kháng DT2000. Nguồn gốc của các giống thí nghiệm được trình bày như bảng 2.1.
Bảng 2.1. Nguồn gốc, đặc điểm của giống thí nghiệm
Giống Nguồn gốc Đặc điểm
DT12 Từ tập đoàn nhập nội giống của
Trung Quốc .
DT2000 Kháng gỉ sắt ở mức độ tốt
Kỹ thuật lây nhiễm:
Khi lây nhiễm, rửa bào tử trực tiếp trên lá với nước cất vô trùng, lọc qua một lần vải để loại bỏ cặn bẩn, xác định mật độ bào tử trong dịch vẩn bằng buồng đếm Goriaev dưới kính hiển vi và điều chỉnh bằng phương pháp pha loãng. Dịch vẩn bào tử với mật độ 5× 104
bào tử / ml được đưa đều lên hai mặt lá bằng bình phun với lượng phun 0,5 ml/ dm2
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 30 http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Trình tự nhiễm bệnh được xác định như sau:
Giống đậu tương ĐT12 được gieo trong nhà lưới trên cùng một nền đất và được chăm sóc với cùng một điều kiện (hình 2.1). Khi cây có một lá kép được mở hoàn toàn, việc lây nhiễm mới được thực hiện.
Dịch vẩn bào tử với mật độ 5×104
bào tử/ ml được đưa đều lên hai mặt lá bằng bình phun với lượng phun 0,5ml/ dm2
lá.
Độ ẩm bão hòa được tạo ra trong thời gian 24 giờ bằng cách phủ nilon lên cây. Trước đó, cây được tưới đẫm nước, đồng thời mặt trong của túi cũng được phun nước lên. Sau đó cây được để trong điều kiện phát triển bình thường trong nhà lưới và tưới nước thường xuyên để tạo độ ẩm cao.
Hình 2.1. Các giống đậu tương được trồng trên đồng ruộng tại Viện bảo vệ thực vật
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 31 http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Cách bố trí thí ngiệm:
Lô đối chứng dương DT2000: là chủng kháng bệnh gỉ sắt được trồng
cách biệt với các lô nhiễm bệnh
Lô DT12 đối chứng: Sau khi cây phun nhiễm bệnh lên cây DT12
được 9 ngày ta thu mẫu lá.
Lô DT12 thí nghiệm: Sau khi phun nhiễm bệnh lên cây DT12 được 6
ngày ta tiến hành phun phức đất hiếm “Thủy tiên” với 4 nồng độ sau: 0,2% ; 0,3%; 0,4%; 0,5%. Với mỗi nồng độ nhắc lại ba lần. Ba ngày sau thu mẫu lá. Do kinh phí thực hiện đề tài có hạn nên chúng tôi lựa chọn nồng độ 0,2% để tiến hành tách chiết protein lá đậu tương và điện di hai chiều.Vì bằng mắt thường chúng tôi nhận thấy ở nồng độ 0.2% lá thí nghiệm cũng đã có biểu hện kháng với bệnh gỉ sắt.
2.2.2. Tách chiết protein từ lá đậu tương
Tách chiết protein từ lá đậu tương để tiến hành điện di SDS - PAGE và điện di hai chiều (2DE) theo phương pháp mô tả sau đây:
Lá đậu tương của các lô thí nghiệm và đối chứng được mô tả ở trên được chọn để nghiên cứu. Lá được làm sạch và cất giữ ở -800C cho đến khi sử dụng.
Nghiền mẫu trong nitơ lỏng
Làm đồng nhất trong 5 thể tích ( 10% TCA trong Acetone chứa 0,07%( w/v) DTT) ủ ở -200C trong 2 giờ. Ly tâm 13000 vòng/ phút 30 phút ở 40
C. Cặn được rửa lại bằng acetone có chứa ( 0,07% (w/v) DTT,1mM PMSF, 2mM EDTA làm đồng nhất dung dịch, ủ ở - 200C trong 1 giờ. Ly tâm 13000 vòng/ phút trong 30 phút ở 40
C (mỗi lần ly tâm xong đổ bỏ dung dịch bên trên, đảo đều cặn, không để vón cục, bổ sung acetone khuấy đều). Lặp lại ba lần cho đến khi mất hết màu xanh diệp lục.
Để bay hơi hết acetone ở nhiệt độ phòng sau khi đã làm tơi cặn khoảng 20-30 phút.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 32 http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Cặn được hòa vào dung dịch sample bufer có chứa 9,0M Urea, 4% CHAPs, 100mM DTT và 2% IPG buffer( 1,6% Bioampholyte5/7+ 0,4% Bioampholyte 3/10) theo tỷ lệ 0,5 gam lá hòa vào 400µl dung dịch. Để ở nhiệt độ phòng 10 phút sau đó sonic 2 lần, mỗi lần 20 phút trong đá lạnh.
Mẫu được giữ ở - 800C cho đến khi sử dụng.
2.2.3. Xác định hàm lượng protein
Hàm lượng protein của mẫu được xác định theo phương pháp Bradford với thuốc nhuộm Quick Start Bradford Dye Regent 1x của hãng Bio-Rad (Bio - Rad, Hercules, Mỹ). Mẫu được pha loãng với tỷ lệ 1:100 và trộn đều với thuốc thử của phản ứng theo hướng dẫn của nhà sản xuất. 25 l mẫu trộn với 1ml thuốc nhuộm, ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút (không nên ủ quá 1 giờ). Mẫu được đo ở bước sóng 595 nm, thí nghiệm được lặp lại 3 lần, sử dụng BSA chuẩn với các nồng độ khác nhau (từ 0,125 mg/ml đến 2 mg/ml) để xây dựng đường chuẩn. Sau khi xác định phương trình đường chuẩn, ta có thể tính toán được nồng độ thực của mẫu theo tỷ lệ pha loãng.
2.2.4 Điện di SDS-PAGE
SDS-PAGE được thực hiện theo Laemmli (1970) [84] với các thiết bị của hãng Bio - Rad. Gel 10%, 12,6% và 15% (w/v) thường được sử dụng để phân tách các protein có trọng lượng phân tử từ 5 kDa - 200 kDa.
Bảng 2.2. Thành phần và các dung dịch đệm SDS-PAGE Thành phần Gel cô 5% 2 ml: 0,5 ml 0,5 M Tris-Cl pH 6.8, 10 l 10% (w/v) SDS, 0,35 ml acrylamid 30 % (w/v), 1,3 ml H2O, 20 l 10% (w/v) APS, 2 l TEMED Gel tách 12,5% 4,5 ml: 1,125 ml 1,5 M Tris-Cl pH 8.8, 45 l 10% (w/v) SDS, 0,9 ml 50% glycerol, 1,89 ml acrylamid 30% (w/v), 0,55 ml H2O, 30 l 10% (w/v) APS, 3 l TEMED Đệm hòa mẫu 5x
25% (v/v) glycerol, 14,4 mM 2-mercapto ethanol, 2% (w/v) SDS, 0,1 (w/v) bromophenol blue, 60 mM 1M Tris-Cl pH 6.8
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 33 http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Mẫu protein được chạy điện di SDS-PAGE trên gel 12,6% với các thành phần cơ bản như ở bảng 2.2.
2.2.5. Điện di hai chiều 2DE
Kỹ thuật điện di hai chiều là sự kết hợp của hai nguyên lý phân tách khác nhau. Theo chiều thứ nhất các phân tử protein được phân tách dựa theo điểm đẳng điện pI trên một thanh cố đinh gradient pH. Chiều thứ hai các phân tử protein được phân tách trên điện di trên gel polyacrylamid (như điện di SDS - PAGE).
Điện di chiều 1 được thực hiện trên máy điện di đẳng điện PROTEAN IEF với thanh cố dịnh gradient pH( ReadyStrip IPG strip); 7cm, pH 3-10 của Bio- Rad( Bio- Rad, Hercules,CA,Mỹ). Gel 2-D được chụp, phân tích và so sánh hình ảnh với sự hỗ trợ của phần mềm Progenesis Samepotrs (Nonlinear Dynamics, Anh).
Điện di chiều thứ nhất (điện di đẳng điện)
110µg protein lá mẫu lá ĐT12 ở thời điểm 9 ngày sau nhiễm bệnh hòa trong 120µl đệm mẫu (9M Urea, 2% CHAPS, 50mM DTT, 0,2% (w/v) Bioampholyte 3/10 và Bromophenol Blue). Các thanh được đúc sẵn tạo giải pH chính xác và thuận tiện khi sử dụng. Mẫu được thấm qua đêm vào các thanh cố định gradient pH 3-10, dài 7cm. Sau đó, các thanh này được tiến hành điện di chiều một trên hệ PROTEAN IEF (Bio-Rad) theo chương trình hiệu điện thế: (i) 250V trong 30 phút; (ii) 4000V trong 3 giờ; (iii) 4000V sao cho VHOUR cuối cùng đạt 11000V.
Cân bằng
Sau quá trình điện di đẳng điện, protein trên gel được cân bằng trong dung dịch có chứa (6M Urea, 2%SDS, Tris HCl pH8.8 0,375 M, glycerone 20%, DTT 2%) và dung dịch chứa ( 6M Urea, 2%SDS, Tris HCl pH8.8 0,375 M, glycerone 20%, Iodoacetamide 0,5 g/20ml cho vào trước khi cân bằng)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 34 http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Điện di chiều hai
Protein trong thanh pH 3-10 sau khi điện di chiều thứ nhất và cân bằng được tiến hành chiều thứ hai (SDS-PAGE) trên gel polyacrylamide 12,5% với điện thế 80V trong 10 phút, 120V trong 30 phút và 150V trong 2 giờ.
Thí nghiệm điện di 2 chiều được lặp lại 3 lần.
2.2.6. Nhuộm protein và phân tích hình ảnh gel
Sau khi chạy điện di SDS - PAGE và điện di 2DE, bản gel được nhuộm bằng Coomassie Brilliant Blue R250/G250 sau khi ủ với dung dịch nhuộm (0,1% (w/v) Coomassie Brilliant Blue, 30% (v/v) methanol, 10% (v/v) axit acetic) trong 30 phút. Bản gel được tẩy rửa bằng dung dịch tẩy (30% (v/v) methanol, 10% (v/v) axit acetic) cho đến khi có thể quan sát thấy các băng protein
Gel được chụp và phân tích hình ảnh với sự hỗ trợ của máy chụp gel chuyên dụng Bio - 5000 Plus của hãng Microtek, Đài Loan. Các điểm protein được so sánh vị trí tương đồng và định lượng mức độ biểu hiện.
2.2.7. Nhận diện protein trên bản điện di 2DE
Các điểm protein được lựa chọn trên bản điện di 2DE được cắt ra từ bản gel polyacrylamide và chuyển vào ống eppendof 1,5 ml. Gel được rửa, loại thuốc nhuộm bằng dung dịch rửa (50 mM NH4HCO3, pH 8.0, 50% ACN). Sau đó, các mảnh gel được làm khô bằng 100% ACN và khử bằng DTT với dung dịch khử chứa 5 mM DTT ở 56oC trong 1h. Sau khi khử, gel được alkyl hóa bằng IAA với dịch alkylation chứa 5 mM IAA trong tối, 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Enzyme trypsin (loại sử dụng cho đọc trình tự, Sigma- Aldrich) được thêm vào với tỷ lệ enzym : cơ chất là 1 : 50, ở 370C qua đêm. Sau khi thủy phân, các peptid được chiết ra khỏi gel bằng dung dịch chiết chứa 50% ACN, 0,1% FA và siêu âm 20 phút. Quá trình triết peptide khỏi gel được lặp lại 3 lần.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 35 http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Sau khi thủy phân protein, peptide được phân tích trên hệ thống khối phổ ESI-Q TRAP của hãng Bruker.
Sau khi chạy khối phổ dữ liệu phổ của protein sẽ được tìm kiếm kết quả phù hợp trên cơ sở dữ liệu bằng phần mềm MASCOT v1.8 (Matrix Science Ltd., London, Anh).
Các thí nghiệm nhận diện protein được thực hiện tại Viện Khoa học
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 36 http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả gây nhiễm bệnh và kiểm tra tính kháng bệnh
Các lô thí nghiệm gây nhiễm bệnh của giống DT12 không được phun phức đất hiếm (giống DT12 đối chứng) và được phun phức đất hiếm (giống DT12 thí nghiệm).
Hình 3.1. Đánh giá khả năng nhiễm bệnh và kháng bệnh của giống DT12
(A): Giống DT12 đối chứng bị nhiễm bệnh không phun phức đất hiếm, sau 9 ngày thu lá. (B): Giống DT12 thí nghiệm phun nhiễm bệnh sau 6 ngày, sau đó phun phức đất hiếm. (C): Giống DT2000 có tính kháng gỉ sắt, làm đối chứng dương.
Đánh giá khả năng kháng bệnh gỉ sắt của phức đất hiếm trên giống đậu tương DT12 chúng ta thấy, khi nhiễm bệnh gỉ sắt cây mới chỉ vài lá nhưng ở phiến lá có những chấm nhỏ màu nâu, cỡ 1mm, nhiều chấm lớn dần màu vàng có kích thước khoảng 2-3mm. Trên một số lá vết bệnh gỉ sắt phát triển mạnh thành từng mảng trên mặt lá (hình 3.1.A). Khi lá bị bệnh gỉ sắt chúng ta quan sát thấy lá thường còi, bé hơn so với bình thường. Tính kháng có thể được quan sát lá bằng mắt thường. Hình dáng của lá DT12 thí nghiệm khá giống với lá DT2000. Cho thấy sau khi bị lây bệnh, nấm gỉ sắt đã tác động đến quá trình sinh trưởng và phát triển của lá, làm biến đổi quá trình
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 37 http://www.lrc-tnu.edu.vn/
sinh lý hóa bình thường. Sau 6 ngày lá nhiễm bệnh, nếu được phun phức đất