3. Nội dung nghiên cứu
1.6.3. Nghiên cứu ứng dụng đất hiếm đối với cây trồng ở Việt Nam
Tại Việt Nam đất hiếm đã được thử nghiệm trên một số cây trồng như: Cây chè, dâu tằm, ngô, lúa và một số loại rau ăn lá cả ở các tỉnh phía bắc và phía nam đều cho kết quả khá tốt.
Kết quả khảo nghiệm phân bón vi lượng đất hiếm trên cây chè (tại Viện Nghiên cứu Chè Phú Hộ - Phú Thọ, công ty chè Sông Lô, Công ty chè Phú Bền và một số hộ trồng chè thuộc huyện Phổ Yên tỉnh Thái Nguyên) từ năm 2004 đến 2007 cho thấy:
Đối với chè kinh doanh : Độ dày tán chè, mật độ búp chè, năng suất chè có tỷ lệ tăng trung bình tương ứng là 15,75%, 21,6% , 15,04% và giảm
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 25 http://www.lrc-tnu.edu.vn/
tỷ lệ mù xoè so với đối chứng. Rút ngắn thời gian giữa 2 lứa hái từ 2 - 3 ngày tỷ lệ búp loại A cao hơn. Hàm lượng đường khử trong búp chè cao, có lợi cho chế biến; các thành phần dinh dưỡng trong búp chè cân đối, chất lượng chè tăng rõ nhất là những biểu hiện cảm quan: Cánh bóng xoăn đều, màu nước xanh sáng hơn so với không sử dụng phân vi lượng đất hiếm. Tăng hương vị của chè, giảm độ đắng và giảm hệ số K khi chế biến.
Đối với chè vườn ươm: Tăng chiều cao cây, đường kính thân, số lá trên cây chè con; tăng khối lượng thân, lá và nhất là sinh khối rễ tăng trung bình 33,8% so đối chứng, giúp chè con khoẻ khi trồng mới. Phân bón vi lượng đất hiếm cũng được áp dụng đối với cây lúa, ngô, dâu tằm (tại Phổ Yên- Tuyên Quang) và rau ăn lá (tại Củ Chi, TP Hồ Chí Minh) đếu cho những kết quả khả quan.
Đối với cây ngô vụ đông (2004) năng suất có khả năng cho tăng từ 10 - 15% tăng khả năng chịu hạn và bệnh khô vằn ít hơn.
Đối với cây lúa: Làm tăng khả năng đẻ nhánh, cây lúa sinh trưởng và phát triển tốt hơn, có thời gian trỗ tập trung hơn nên hạn chế được sâu đục thân.
Đối với cây dâu tằm năng suất lá tăng 43% so với đối chứng, chất lượng tốt, tằm ăn khoẻ, năng suất kén tăng
Đối với rau ăn lá: giữa các công thức sử dụng đất hiếm tỷ lệ chênh lệch không đáng kể. So với đối chứng năng suất ớ các công thức sử dụng đất hiếm tăng từ 39 - 49%. Như vậy đối với điều kiện đất xám bạc màu như Củ Chi Thành phố Hồ Chí Minh đất hiếm có tác dụng rất rõ.
Ở Việt Nam, hiện tại các nguyên tố đất hiếm đã được khai thác sử dụng như là một yếu tố bổ sung dinh dưỡng thúc đẩy tăng trưởng và tăng năng suất cây trồng. Ở một khía cạnh nào đó đất hiếm cũng đã được nhìn nhận có khả năng làm tăng tính kháng của cây.
Nghiên cứu ứng dụng đất hiếm kích thích tính kháng bệnh của cây trồng nói chung, cũng như đối với cây đậu tương là một vấn đề còn mới
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 26 http://www.lrc-tnu.edu.vn/
mẻ. Trong những năm gần đây, các nghiên cứu về bệnh gỉ sắt ở đậu tương đã được tiến hành và thu được một số kết quả đáng kể. Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu trên đều tập trung vào gen, nghiên cứu lập bản đồ gen kháng, đánh giá sự tổn thất năng suất, nghiên cứu dịch tễ học, đánh giá quá trình phát triển hoặc nguy cơ phát triển bệnh, cũng như đánh giá tuyển chọn các giống đậu tương có tính kháng bệnh. Các nghiên cứu chưa đi sâu vào nghiên cứu thành phần hóa sinh, sự đa dạng di truyền trong cấu trúc gen và kích thích tính kháng thông qua hệ protein được coi là khá bảo thủ của cây đậu tương.
1.7. Protein ở lá cây đậu tƣơng
1.7.1. Thành phần protein ở lá cây đậu tương
Chức năng chính của lá là thu nhận quang năng, chuyển hóa chúng và dữ trữ dưới dạng các liên kết hóa học. Do đó, có một số lượng lớn các protein của lá đậu tương là các protein liên quan đến quá trình trao đổi chất và năng lượng. Các protein lá đậu tương có liên quan đến quá trình vận chuyển điện tử như reaction centre subunit, PSII oxygen-evolving complex protein, carbonic anhydrase, ferrodoxin. Các enzyme liên quan đến quá trình trao đổi và chuyển hóa carbon như rubisco, malate dehydrogenase, sedoheptulose-1,7-biphosphatase, phosphoglycerate kinase, glyceraldehyde- 3-phosphate dehydrogenase, triosephosphate isomerase. Rubisco là enzyme chính có vai trò rất quan trọng trong quá trình cố định carbon. Hệ protein lá đậu tương còn có các protein dự trữ như vegetative storage protein [17], stem 28 kDa protein, cyclophilin,các protein có liên quan đến các quá trình trao đổi và chuyển hóa của các amino acid hoặc các protein liên quan đến tính kháng bệnh, chống chịu stress như ascorbate peroxidase, catalase.
1.7.2. Những nghiên cứu protenin ở lá đậu tương
Việc nghiên cứu và lập bản đồ điện di hệ protein cũng như xác định các protein lá của đậu tương đã được tiến hành trong những năm gần đây
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 27 http://www.lrc-tnu.edu.vn/
[50], [63], [84]. Bước đầu đã có một số công bố tiến hành phân tích hệ protein lá đậu tương kháng bệnh gỉ sắt cũng như lập bản đồ điện di hệ protein lá và định danh chúng để làm căn cứ so sánh, nghiên cứu các protein liên quan đến bệnh lý.
Kết quả “Nghiên cứu thành phần Protein lá đậu tương nhiễm bệnh gỉ sắt bằng phương pháp điện di 1 chiều” [9] - điện di biến tính trên gel polyacylamide (SDS - PAGE) của proein tổng số, đối với lá các giống đậu tương sau khi nhiễm bệnh gỉ sắt cho thấy, mẫu protein lá đều bị phân hủy tạo thành vệt dài trên điện di; mẫu lá nhiễm bệnh sau 7 ngày phát hiện thấy 19- 21 băng, trong đó có những protein chính của lá như rubisco tiểu phần lớn và tiểu phần nhỏ, chưa phát hiện được sự thay đổi rõ rệt giữa giống kháng và giống nhiễm cũng như đối chứng không nhiễm bệnh. Phương pháp sử dụng TCA và aceton cho kết quả phát hiện được trên 110 vệt protein trên lá không nhiễm bệnh.
Cho đến nay, các nghiên cứu về protein lá đậu tương còn rất hạn chế. Các kết quả trên mới chỉ là những bước khởi đầu, tạo tiền đề cho việc nghiên cứu sự biểu hiện khác nhau của các protein trong môi trường bất lợi, hoặc trong các điều kiện kháng vi sinh vật gây hại và sâu bệnh. Điều này có vai trò rất quan trọng trong nghiên cứu chức năng của các protein có liên quan đến tính kháng bệnh của cây đậu tương, nhằm cải thiện chất lượng và năng suất đậu tương. Để tiếp thu và phát huy những kỹ thuật khoa học đang được ứng dụng rộng rãi cho nghiên cứu protein của cây đậu tương, đặc biệt là ở lá. Chúng tôi sử dụng cây đậu tương ĐT12 mẫn cảm với bệnh gỉ sắt, sử dụng phức đất hiếm “Thủy tiên” xử lý hạt trước khi gieo và phun lên lá sau khi cây đậu tương được phun nhiễm bệnh gỉ sắt nhân tạo ở giai đoạn có hai lá kép để phục vụ cho nghiên cứu. Sử dụng phương pháp điện di hai chiều để phân tích những biến đổi protein trong lá đậu tương nhiễm bệnh khi được xử lý phức đất hiếm, nhằm đánh giá phản ứng của cây đậu tương cũng như phân tích sự khác biệt về thành phần điện di protein trong lá đậu tương nhiễm bệnh và không nhiễm bệnh.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 28 http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Chƣơng 2
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu
2.1.1. Vật liệu và phương pháp thu thập lá bệnh
Đề tài đã sử dụng giống đậu tương ĐT12 do Viện Bảo Vệ Thực (VBVTV) vật cung cấp
Nguồn bệnh gỉ sắt:
Nguồn bệnh để lây nhiễm là bào tử của lá nhiễm bệnh được chuẩn bị trong nhà lưới của VBVTV.
Nguyên tắc thu thập lá bệnh: Chọn lá còn xanh, bị bệnh trên 50% diện tích lá, vết bệnh nổi gờ cao. Do nguồn bệnh hạn chế nên rửa trực tiếp lá bệnh trên cây nhằm duy trì nguồn bệnh.
Địa điểm thí ngiệm: tại nhà lưới của Viện Bảo Vệ Thực Vật, và phòng thí nghiệm của trường Đại học sư phạm Thái Nguyên
2.1.2. Hóa chất
Tất cả các hóa chất đều có độ tinh sạch cần thiết theo khuyến cáo của nhà sản xuất. Các hóa chất điện di SDS - PAGE, điện di 2DE, thuốc nhuộm Quick Start Bradford Dye Regent 1X được mua từ hãng Bio - Rad (Hercules, CA, Mỹ). Nitơ lỏng mua tại Việt Nam
Urea, CHAPs, DTT (Dithiothreitol), SDS, Tris HCl 8.8, glycerol, biosmpholyte 3/10, bioampholyte 5/7, bromophenol blue, iodoacetamide, coomassie G250, methanol, H3PO4, acrylamid/ Biss, APS, temed, TCA.
Aurum serum protein mini kit, 2-D Starter kit mua từ Bio-Rad (Hercules, CA, Mỹ) và coomassie brilliant blue R250 mua từ MP biomedicals (MP Biomedicals, Eschwege, Đức).
Phức đất hiếm “Thủy tiên” do viện Công Nghệ Xạ Hiếm cung cấp. Thành phàn cử “Thủy tiên” gồm:La:1,5%; Ce: 2,0%; các đất hiếm khác: 1,5%; Zn: 0,05%; Mn: 0,05%; chất hoạt hóa: 0,15%....
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 29 http://www.lrc-tnu.edu.vn/
2.1.3. Máy móc và thiết bị
Máy điện di protein SDS - PAGE của hàng Cleaver Scientific, Anh Hệ điện di 2 chiều 2-DE được thực hiện trên hệ điện di đẳng điện PROTEAN IEF mua từ Bio - Rad, Mỹ.
Máy chụp gel chuyên dụng Bio-5000 Plus của hãng Microtek, Đài Loan. Máy li tâm lạnh Hettich (Đức).
Máy ly tâm Eppendorf 5415C (Eppendorf, Đức). Máy khuấy trộn (Voltex) (Minishaker, IKA, Đức.
Lò vi sóng (SamSung, Hàn Quốc), tủ sấy của hãng Carbolite (Anh), tủ lạnh -200 (Sanyo, Nhật Bản), pipetman, giá đổ điện di, cối chày sứ, bể ổn nhiệt, nồi khử trùng…
2.2. Phƣơng pháp nhiên cứu
2.2.1. Phương pháp nhiễm bệnh nhân tạo và thu mẫu lá
Thí nghiệm được bố trí trong khu cách biệt của nhà lưới với 3 lần nhắc lại để đánh giá khả năng kháng bệnh của giống ĐT12 sau khi được xử lý bằng phức đất hiếm “Thủy tiên”. Mẫu đối chứng là mẫu kháng DT2000. Nguồn gốc của các giống thí nghiệm được trình bày như bảng 2.1.
Bảng 2.1. Nguồn gốc, đặc điểm của giống thí nghiệm
Giống Nguồn gốc Đặc điểm
DT12 Từ tập đoàn nhập nội giống của
Trung Quốc .
DT2000 Kháng gỉ sắt ở mức độ tốt
Kỹ thuật lây nhiễm:
Khi lây nhiễm, rửa bào tử trực tiếp trên lá với nước cất vô trùng, lọc qua một lần vải để loại bỏ cặn bẩn, xác định mật độ bào tử trong dịch vẩn bằng buồng đếm Goriaev dưới kính hiển vi và điều chỉnh bằng phương pháp pha loãng. Dịch vẩn bào tử với mật độ 5× 104
bào tử / ml được đưa đều lên hai mặt lá bằng bình phun với lượng phun 0,5 ml/ dm2
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 30 http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Trình tự nhiễm bệnh được xác định như sau:
Giống đậu tương ĐT12 được gieo trong nhà lưới trên cùng một nền đất và được chăm sóc với cùng một điều kiện (hình 2.1). Khi cây có một lá kép được mở hoàn toàn, việc lây nhiễm mới được thực hiện.
Dịch vẩn bào tử với mật độ 5×104
bào tử/ ml được đưa đều lên hai mặt lá bằng bình phun với lượng phun 0,5ml/ dm2
lá.
Độ ẩm bão hòa được tạo ra trong thời gian 24 giờ bằng cách phủ nilon lên cây. Trước đó, cây được tưới đẫm nước, đồng thời mặt trong của túi cũng được phun nước lên. Sau đó cây được để trong điều kiện phát triển bình thường trong nhà lưới và tưới nước thường xuyên để tạo độ ẩm cao.
Hình 2.1. Các giống đậu tương được trồng trên đồng ruộng tại Viện bảo vệ thực vật
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 31 http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Cách bố trí thí ngiệm:
Lô đối chứng dương DT2000: là chủng kháng bệnh gỉ sắt được trồng
cách biệt với các lô nhiễm bệnh
Lô DT12 đối chứng: Sau khi cây phun nhiễm bệnh lên cây DT12
được 9 ngày ta thu mẫu lá.
Lô DT12 thí nghiệm: Sau khi phun nhiễm bệnh lên cây DT12 được 6
ngày ta tiến hành phun phức đất hiếm “Thủy tiên” với 4 nồng độ sau: 0,2% ; 0,3%; 0,4%; 0,5%. Với mỗi nồng độ nhắc lại ba lần. Ba ngày sau thu mẫu lá. Do kinh phí thực hiện đề tài có hạn nên chúng tôi lựa chọn nồng độ 0,2% để tiến hành tách chiết protein lá đậu tương và điện di hai chiều.Vì bằng mắt thường chúng tôi nhận thấy ở nồng độ 0.2% lá thí nghiệm cũng đã có biểu hện kháng với bệnh gỉ sắt.
2.2.2. Tách chiết protein từ lá đậu tương
Tách chiết protein từ lá đậu tương để tiến hành điện di SDS - PAGE và điện di hai chiều (2DE) theo phương pháp mô tả sau đây:
Lá đậu tương của các lô thí nghiệm và đối chứng được mô tả ở trên được chọn để nghiên cứu. Lá được làm sạch và cất giữ ở -800C cho đến khi sử dụng.
Nghiền mẫu trong nitơ lỏng
Làm đồng nhất trong 5 thể tích ( 10% TCA trong Acetone chứa 0,07%( w/v) DTT) ủ ở -200C trong 2 giờ. Ly tâm 13000 vòng/ phút 30 phút ở 40
C. Cặn được rửa lại bằng acetone có chứa ( 0,07% (w/v) DTT,1mM PMSF, 2mM EDTA làm đồng nhất dung dịch, ủ ở - 200C trong 1 giờ. Ly tâm 13000 vòng/ phút trong 30 phút ở 40
C (mỗi lần ly tâm xong đổ bỏ dung dịch bên trên, đảo đều cặn, không để vón cục, bổ sung acetone khuấy đều). Lặp lại ba lần cho đến khi mất hết màu xanh diệp lục.
Để bay hơi hết acetone ở nhiệt độ phòng sau khi đã làm tơi cặn khoảng 20-30 phút.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 32 http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Cặn được hòa vào dung dịch sample bufer có chứa 9,0M Urea, 4% CHAPs, 100mM DTT và 2% IPG buffer( 1,6% Bioampholyte5/7+ 0,4% Bioampholyte 3/10) theo tỷ lệ 0,5 gam lá hòa vào 400µl dung dịch. Để ở nhiệt độ phòng 10 phút sau đó sonic 2 lần, mỗi lần 20 phút trong đá lạnh.
Mẫu được giữ ở - 800C cho đến khi sử dụng.
2.2.3. Xác định hàm lượng protein
Hàm lượng protein của mẫu được xác định theo phương pháp Bradford với thuốc nhuộm Quick Start Bradford Dye Regent 1x của hãng Bio-Rad (Bio - Rad, Hercules, Mỹ). Mẫu được pha loãng với tỷ lệ 1:100 và trộn đều với thuốc thử của phản ứng theo hướng dẫn của nhà sản xuất. 25 l mẫu trộn với 1ml thuốc nhuộm, ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút (không nên ủ quá 1 giờ). Mẫu được đo ở bước sóng 595 nm, thí nghiệm được lặp lại 3 lần, sử dụng BSA chuẩn với các nồng độ khác nhau (từ 0,125 mg/ml đến 2 mg/ml) để xây dựng đường chuẩn. Sau khi xác định phương trình đường chuẩn, ta có thể tính toán được nồng độ thực của mẫu theo tỷ lệ pha loãng.
2.2.4 Điện di SDS-PAGE
SDS-PAGE được thực hiện theo Laemmli (1970) [84] với các thiết bị của hãng Bio - Rad. Gel 10%, 12,6% và 15% (w/v) thường được sử dụng để phân tách các protein có trọng lượng phân tử từ 5 kDa - 200 kDa.
Bảng 2.2. Thành phần và các dung dịch đệm SDS-PAGE Thành phần Gel cô 5% 2 ml: 0,5 ml 0,5 M Tris-Cl pH 6.8, 10 l 10% (w/v) SDS, 0,35 ml acrylamid 30 % (w/v), 1,3 ml H2O, 20 l 10% (w/v) APS, 2 l TEMED Gel tách 12,5% 4,5 ml: 1,125 ml 1,5 M Tris-Cl pH 8.8, 45 l 10% (w/v) SDS, 0,9 ml 50% glycerol, 1,89 ml acrylamid 30% (w/v), 0,55 ml H2O, 30 l 10% (w/v) APS, 3 l TEMED Đệm hòa mẫu 5x
25% (v/v) glycerol, 14,4 mM 2-mercapto ethanol, 2% (w/v) SDS, 0,1 (w/v) bromophenol blue, 60 mM 1M Tris-Cl pH 6.8
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 33 http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Mẫu protein được chạy điện di SDS-PAGE trên gel 12,6% với các thành phần cơ bản như ở bảng 2.2.
2.2.5. Điện di hai chiều 2DE
Kỹ thuật điện di hai chiều là sự kết hợp của hai nguyên lý phân tách khác nhau. Theo chiều thứ nhất các phân tử protein được phân tách dựa theo điểm đẳng điện pI trên một thanh cố đinh gradient pH. Chiều thứ hai các phân tử protein được phân tách trên điện di trên gel polyacrylamid (như điện di SDS - PAGE).
Điện di chiều 1 được thực hiện trên máy điện di đẳng điện PROTEAN IEF với thanh cố dịnh gradient pH( ReadyStrip IPG strip); 7cm, pH 3-10 của