phân lập đối với vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae trong điều kiện phòng thí nghiệm.
* Mục tiêu thí nghiệm
Đánh giá khả năng đối kháng của các chủng xạ khuẩn phân lập đối với chủng vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae gây bệnh cháy bìa lá lúa trong điều kiện phòng thí nghiệm.
Gồm 2 thí nghiệm
− Thí nghiệm 2a: đánh giá khả năng đối kháng nhanh của 142 chủng xạ khuẩn đối với vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae trên đĩa petri trong điều kiện phòng thí nghiệm đƣợc thực hiện với không lần lặp lại, nhằm chọn ra những chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng với vi khuẩn X.oryzae pv. oryzae.
−Thí nghiệm 2b: đánh giá khả năng đối kháng của các chủng xạ khuẩn đƣợc chọn lọc ở thí nghiệm 2a với vi khuẩn X.oryzae pv. oryzae đƣợc thực hiện trên đĩa petri, thí nghiệm đƣợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 5 lần lặp lại trong đó mỗi chủng xạ khuẩn đƣợc xem là một nghiệm thức.
Phƣơng pháp thí nghiệm: thí nghiệm 2a và 2b đƣợc thực hiện với phƣơng pháp giống nhau.
Những chủng xạ khuẩn đƣợc cấy trong ống nghiệm chứa môi trƣờng MS để mặt nghiêng trong 120 giờ. Vi khuẩn gây bệnh đƣợc nhân nuôi trong đĩa petri chứa môi trƣờng Wakimoto cải tiến, xác định mật số và chuyển về huyền phù vi khuẩn có mật số 108 cfu/ml.
Sau đó nhỏ 200 μl huyền phù vi khuẩn gây bệnh Xanthomonas oryzae pv.
oryzae vào ống nghiệm chứa 12 ml môi trƣờng King’B đã đƣợc nấu tan và giữ ấm ở 530C. Khuấy đều bằng vortex sau đó đỗ ra đĩa petri đã thanh trùng và để nguội. Trên mỗi đĩa petri chứa vi khuẩn gây bệnh đƣợc đục 4 lỗ (đối với thí nghiệm 1a) và 2 lỗ (đối với thí nghiệm 1b) đối xứng với tâm đĩa petri cho tƣơng xứng, mỗi lỗ có đƣờng kính là 5 mm. Sau đó bơm 10 μl huyền phù xạ khuẩn khác nhau vào mỗi lỗ. Sau đó các đĩa đƣợc đặt trong tủ úm 280C.
Xạ khuẩn 3 Xạ khuẩn 4 Xạ khuẩn 1 Xạ khuẩn 2
Hình 2.2. Phƣơng pháp thử khả năng đối kháng của xạ khuẩn đối với vi khuẩn
* Chỉ tiêu ghi nhận:
Tiến hành lấy chỉ tiêu khi bắt đầu xuất hiện vòng vô khuẩn. Ghi nhận bán kính vòng vô khuẩn vào các thời điểm 2, 4, 6 ngày sau khi nuôi cấy.
Các số liệu đƣợc xử lý trên phần mềm Microsoft Office Excel và phân tích bằng phần mềm thống kê MSTATC qua phép thử Duncan.
Xạ khuẩn 1 Xạ khuẩn 2
Hình 2.3. Phƣơng pháp thử khả năng đối kháng của xạ khuẩn đối với vi khuẩn
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Kết quả phân lập vi khuẩn gây bệnh Xanthomonas oryzae pv. oryzae
Quá trình thu mẫu cho thấy bệnh xuất hiện suốt từ thời kỳ mạ đến khi lúa chín nhƣng phổ biến nhất là giai đoạn lúa đẻ nhánh trở về sau. Triệu chứng điển hình là trên phiến lá có những đƣờng kẻ dài không đều, hoặc thƣờng ở chóp lá tạo thành một sọc dài nhũn nƣớc hay ở hai bên bìa lá, khi đẫm nƣớc vết bệnh sẽ lan dài ra những vết có màu vàng và phát triển dần ra tạo thành màu vàng xám khô chạy theo hai bìa lá (Hình 3.1 và Hình 3.2). Đặc biệt khi thu mẫu vào buổi sáng sẽ dễ dàng phát hiện các giọt dịch khuẩn màu trắng sữa hoặc vàng sáp trên bề mặt các vết bệnh mới. Chúng khô đi thành những viên nhỏ, hình tròn, màu vàng nhạt, dễ dàng bị gió làm rụng và nổi trên mặt nƣớc. Bệnh thƣờng gây hại nghiêm trọng vào những tháng có nhiệt độ cao, những ruộng bón thừa phân đạm và trên các giống nhiễm đặc biệt là giống jasmine.
Từ những mẫu bệnh thu thập đƣợc từ các ruộng lúa ở 3 tỉnh ĐBSCL (An Giang, Cần Thơ, Vĩnh Long) và phân lập trên môi trƣờng Wakimoto cải tiến, kết quả thu đƣợc 10 chủng vi khuẩn gây bệnh cháy bìa lá lúa Xanthomonas oryzae pv.
oryzae (bảng 3.1).
Bảng 3.1: 10 chủng vi khuẩn gây bệnh cháy bìa lá lúa Xanthomonas oryzae pv. oryzae phân lập từ các ruộng lúa tại 3 tỉnh An Giang, Cần Thơ, Vĩnh Long.
Stt Ký hiệu Địa điểm thu mẫu bệnh
1 Xoo_BM.VL Đông Thành – Thị xã Bình Minh – Tỉnh Vĩnh Long 2 Xoo_TN.CT Phƣờng Thuận Hƣng – Quận Thốt Nốt – Tp. Cần Thơ 3 Xoo_TS.AG Xã Vọng Đông – Huyện Thoại Sơn – Tỉnh An Giang 4 Xoo_CR.CT Phƣờng Ba Láng – Quận Cái Răng – Tp. Cần Thơ 5 Xoo_CT.AG Xã Vĩnh Bình – Huyện Châu Thành – Tỉnh An Giang 6 Xoo_MT.VL Thị Trấn Cái Nhum – Huyện Mang Thít – Tỉnh Vĩnh Long 7 Xoo_PD.CT Thị Trấn Phong Điền – Huyện Phong Điền – Tp. Cần Thơ 8 Xoo_TO.VL Xã Vĩnh Xuân – Huyện Trà Ôn – Tỉnh Vĩnh Long 9 Xoo_OM.CT Phƣờng Thới Long – Quận Ô Môn – Tp. Cần Thơ 10 Xoo_BT.CT Phƣờng Long Hòa – Quận Bình Thủy – Tp. Cần Thơ
Ghi chú: Xoo_BM.VL: Xanthomonas oryzae pv. oryzae_Bình Minh Vĩnh Long
Vi khuẩn ban đầu đƣợc tách ròng trên môi trƣờng King’B hình thành các khuẩn lạc nhỏ, trong, có màu vàng đặc trƣng của chi Xanthomonas và không phát huỳnh quang. Sau đó vi khuẩn đƣợc vạch trên môi trƣờng Wakimoto cải tiến (có sắt), thấy vi khuẩn phát triển tốt hơn môi trƣờng King’B và đúng với nhận định của EPPO (1999) về khả năng phát triển tốt của vi khuẩn trên môi trƣờng chứa đƣờng. Nhìn chung, cả 10 chủng vi khuẩn khi cấy trên môi trƣờng Wakimoto cải tiến thì
thấy khuẩn lạc tròn, lồi, bóng, viền đều, có màu vàng nhạt khi mới và màu vàng sậm dần khi già giống nhƣ mô tả của Ou (1985) (Hình 3.3).
Hình 3.1. Triệu chứng gây hại ngoài đồng của bệnh cháy bìa lá lúa do vi khuẩn
Xanthomonas oryzae pv. oryzae gây ra.
Hình 3.2. Vết bệnh biểu hiện trên lá lúa từ các mẫu thu thập ngoài đồng