Mẫu bệnh thu về cần đƣợc giữ riêng biệt và phân lập ngay trong ngày hoặc ngày sau đó. Ở phòng thí nghiệm, mẫu đƣợc xem dƣới kính hiển vi nhằm xác định đúng tác nhân gây bệnh trƣớc khi phân lập trong đĩa petri.
Cách phân lập:
1) Cắt 1 phần vết bệnh (vùng ranh giới giữa mô bệnh và mô khỏe) quan sát dƣới kính hiển vi, nếu có vi khuẩn tuôn ra từ vết bệnh thì dùng phần vết bệnh còn lại đem phân lập.
3) Nhẹ nhàng lau khử trùng bề mặt vết bệnh bằng cồn etyl 700. 4) Dùng lƣỡi lam cắt mẫu vết bệnh dọc gân lá khoảng 40 mm2
(vùng ranh giới giữa mô bệnh và mô khỏe) sau đó cắt nhỏ mẫu bệnh thành những miếng nhỏ với diện tích mẫu cắt (1x1 mm) trên lame đã khử trùng, nhỏ vào 1ml nƣớc cất vô trùng đợi 1 – 2 phút cho dịch vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae trong các mô lá tuôn ra.
5) Sử dụng micropipette hút 50 μl dịch vi khuẩn, chà lên đĩa petri có chứa môi trƣờng Wakimoto cải tiến (Karganilla và ctv, 1973).
Dùng que cấy đã khử trùng vạch giọt huyền phù vi khuẩn theo hình vẽ minh họa (Hình 2.1):
Hình 2.1: sơ đồ minh họa đĩa cấy vi khuẩn trên môi trƣờng Wakimoto cải tiến.
6) Để ở nhiệt độ phòng cho tới khi quan sát thấy khuẩn lạc xuất hiện, chọn các khuẩn lạc có dạng tròn nhẵn, lồi, màu vàng chanh (Akhtar et al.,2008), đồng thời tiến hành tách ròng cho đến khi có đƣợc vi khuẩn đồng nhất. Vi khuẩn
Xanthomonas oryzae pv. oryzae sau khi phân lập đƣợc trữ trong môi trƣờng Wakimoto cải tiến đổ mặt nghiêng. Đây là những mẫu thuần dùng cho các thí nghiệm tiếp theo.