Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian: đề tài được tiến hành từ tháng 12/2012 đến tháng 11/2013

Địa điểm: đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm phát triển chế phẩm sinh học (NEDO), Bộ môn Bảo vệ Thực vật (BVTV), Khoa Nông Nghiệp và Sinh học Ứng Dụng, Trường Đại học Cần Thơ.

3.2 Phƣơng tiện

- Sâu sạch (tuổi 2): SAT được thu ngoài đồng nuôi trong điều kiện phòng thí nghiệm với thức ăn nhân tạo được nghiên cứu là tốt nhất cho sự phát triển của sâu do Bộ môn BVTV sản xuất (Trần Thị Thuỳ Dung, 2008), nuôi SAT trong hộp nhựa (10 x 20 x 20 cm). Khi sâu hóa nhộng và vũ hóa sẽ được chuyển sang bọc giấy có bổ sung 3% nước đường để bướm đẻ trứng, cắt những ổ trứng và khử bằng formalin 3% sau đó rửa ổ trứng qua nước sạch, làm khô ráo các ổ trứng này và để trứng vào trong hộp nhựa (70 ml) đến khi trứng nở sâu non. Tuy nhiên, để loại bỏ tác nhân nguyên sinh động vật (protozoa) thì sẽ tiến hành kiểm tra bướm bố mẹ để loại bỏ những ổ trứng có bướm bố mẹ nhiễm nguyên sinh động vật nhằm thu được các thế hệ sâu non sạch bệnh.

Hình 3.1: Nhân nuôi sâu sạch trong phòng thí nhiệm

- Nguồn vi rút: chủng vi rút SpltNPV kế thừa kết quả thí nghiệm của Trịnh Thị Xuân (2011); Vương Bích Vân (2010) bảo quản ở điều kiện lạnh (40C).

- Sản xuất chế phẩm:

 Dạng lỏng: Vi rút NPV (107OBs/ml) + 20% Glycerin+ 1% Boric acid.  Dạng bột: Vi rút NPV (107OBs/ml) + 20% Glycerin+ 1% Boric acid + 50% than hoạt tính.

 Đối với dạng bột sau khi phối trộn sẽ đợi cho than hoạt tính hấp thụ vi rút NPV, sau đó sấy khô trong tủ sấy (Sanyo MOV-121F) ở nhiệt độ 26 - 290C với thời gian là 18 giờ. Sau khi phối trộn được hai dạng lỏng và bột sẽ tồn trữ ở 40C và điều kiện nhiệt độ phòng.

- Hóa chất: chất phụ gia (acid boric), glycerin, chất hút ẩm (than hoạt tính), chlorine.

- Vật liệu: hộp nuôi sâu, thức ăn nhân tạo, giấy lót, beaker, bình tam giác, nước cất, giấy thấm, kẹp inox, cọ lông, kéo, keo dán, bút lông, lame đếm Thoma, lamell, pipette, cồn 70% để khử trùng dụng cụ, bọc giấy, đồng hồ đo nhiệt độ ẩm độ…

- Các loại thiết bị: kính hiển vi huỳnh quang, máy Vortex, máy ly tâm lạnh, máy thanh trùng, tủ lạnh 40C, cân điện tử…

3.3 Phƣơng pháp

- Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên với 6 nghiệm thức trong đó 5 nghiệm thức là các dạng chế phẩm vi rút và nghiệm thức đối chứng (sử dụng nước cất thanh trùng), mỗi nghiệm thức có 4 lần lập lại, mỗi lần lập lại gồm 24 ấu trùng SAT tuổi 2 (trước khi bố trí thí nghiệm cần bỏ đói SAT trước 12 giờ). Sử dụng phương pháp lây nhiễm qua thức ăn (Shorey và Hale, 1965), nhỏ 10µl dung dịch vi rút vào thức ăn nhân tạo (đường kính 6 mm, dầy 3 mm), trộn lẫn vi rút vào thức ăn và cho vào khuôn

Hình 3.2: Chế phẩm SpltNPV dạng khô

Hình 3.3: Chế phẩm SpltNPV dạng lỏng

chủng Test plate (đường kính 30 mm), chuyển từng cá thể sâu vào khuôn chủng (1 khuôn có 24 ô). Sau 2 ngày sẽ chuyển sâu từ khuôn chủng ra từng hộp nhỏ (30 ml) để theo dõi quan sát hàng ngày.

- Thí nghiệm được thực hiện sau 1, 3, 5, 8 và 12 tháng sau khi sản xuất bảo quản ở hai điều kiện (40C và 250C) sau khi sản xuất.

- Các chỉ tiêu theo dõi:

 Triệu chứng: ghi nhận triệu chứng gây chết của các chủng vi rút đối SAT. Ở các thời điểm 3, 5, 7, 9, 12 ngày sau khi chủng.

 Độ hữu hiệu: Tính bằng công thức Abbott, 1925. C - T

ĐHH (%) = --- x 100 C

C: số sâu còn sống ở nghiệm thức đối chứng T: số sâu còn sống ở nghiệm thức chủng vi rút

Xử lý số liệu bằng phần mềm Excel, thống kê số liệu bằng chương trình MSTATC.

CHƢƠNG 3

KẾT QUẢ THẢO LUẬN

4.1 Hiệu lực của chế phẩm vi rút NPV sau 1 tháng sản xuất

Qua kết quả thí nghiệm Bảng 4.1 cho thấy 2 dạng chế phẩm lỏng và khô được bảo quản trong điều kiện 40

C và 250C đều có hiệu quả đối với SAT tuổi 2 ở mọi thời điểm quan sát.

Bảng 4.1: Độ hữu hiệu của chế phẩm vi rút NPV đối với SAT sau khi sản xuất 1 tháng trong điều kiện phòng thí nghiệm.

T: 29,5ºC, RH: 80%

Nghiệm thức Độ hữu hiệu (%) qua các ngày sau khi chủng

3 5 7 9 12 Lỏng (250C) 4,3 18,6b 58,3b 88,5b 91,9 Lỏng (40C) 10,6 40,7b 78,0ab 90,2b 90,2 Khô (250C) 5,4 25,5b 77,1b 84,6b 88,9 Khô (40C) 7,6 34,4b 81,3ab 86,6b 89,9 Vi rút (tinh khiết) 10,9 86,9a 97,8a 100,0a 100,0 CV (%) 43,2 23,6 18,7 13,2 11,1 F ns ** ** ** ns

Các số trong cùng một cột có chữ theo sau giống nhau thì không khác biệt có ý nghĩa thống kê. ns: không khác biệt qua phân tích thống kê; *: khác biệt ở mức ý nghĩa 5%; **: khác biệt ở mức ý nghĩa 1%

Ở thời điểm 3 ngày sau khi chủng vi rút vào thức ăn cho thấy nghiệm thức bảo quản điều kiện 40C của cả 2 dạng chế phẩm lỏng và khô cho hiệu quả cao hơn các nghiệm thức còn lại tuy nhiên sự khác biệt này không có ý nghĩa qua phân tích thống kê.

Quan sát và ghi nhận chỉ tiêu sau 5 ngày cho ăn cho thấy hiệu lực của các dạng vi rút tăng cao. Hiệu quả cao nhất đó là vi rút tinh khiết (vi rút thuần) có độ hữu hiệu là 86,9% khác biệt hoàn toàn qua phân tích thống kê ở mức ý nghĩa 1% so với các nghiệm thức còn lại. So sánh các nghiệm thức còn lại cho thấy chế phẩm vi rút ở dạng lỏng và dạng khô được bảo quản ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau đều có hiệu quả đối với SAT, tuy nhiên giữa các nghiệm thức này lại không có sự khác biệt nhau qua phân tích thống kê. Điều này có thể lý giải là do chế phẩm vi rút NPV mới sản xuất một tháng nên mặc dù

được trữ ở hai điều kiện khác nhau nhưng vẫn cho hiệu quả tương đương nhau, chế phẩm chưa bị mất hoạt lực bởi các yếu tố như nhiệt độ, ẩm độ bên ngoài.

Đến ngày thứ 7 sau khi chủng cho thấy các nghiệm thức có sự khác biệt qua phân tích thống kê ở mức ý nghĩa 1%. Trong đó nghiệm thức có độ hữu hiệu cao nhất là nghiệm thức sử dụng vi rút tinh khiết (97,8%) và không khác biệt ở mức ý nghĩa 1% khi so với chế phẩm vi rút ở dạng lỏng và khô trong điều kiện tồn trừ 40C (lần lượt là 78,0 và 81,3 %) nhưng khác biệt so với 2 nghiệm thức còn lại là chế phẩm vi rút lỏng và khô khi tồn trữ ở điều kiện nhiệt độ 250C lần lượt đạt 58,3%; 77,1 %. Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Trịnh Thị Xuân (2011) khi cho rằng chế phẩm vi rút NPV sau khi sản xuất 1 tháng ở dạng khô sẽ có hiệu quả từ 50 – 80% tại thời điểm 7 ngày sau khi chủng khi đánh giá trên SAT.

Hiệu lực của chế phẩm vi rút NPV càng thể hiện rõ sau 9 ngày, trong đó nghiệm thức vi rút tinh khiết đạt hiệu quả đạt cao nhất (100%) và khác biệt so với các dạng chế phẩm lỏng và khô được bảo quản ở các điều kiện khác nhau ở mức ý nghĩa 1% qua phân tích thống kê. Trong khi đó, các nghiệm thức chế phẩm vi rút tuy có sự khác biệt nhau nhưng sự khác biệt này lại không có ý nghĩa qua phân tích thống kê.

Theo dõi ngày tiếp theo 12 ngày sau khi chủng thức ăn cho thấy hiệu lực củacác nghiệm thức không khác biệt qua phân tích thống kê và cho hiệu lực tương đương nhau.

4.2 Hiệu lực của hai dạng chế phẩm vi rút NPV sau 3 tháng sản xuất

Từ kết quả Bảng 4.2 cho thấy hiệu quả sản phẩm vi rút sau 3 tháng sản xuất tại bộ môn Bảo Vệ Thực Vật vẫn cho hiệu lực cao đối với SAT.

Bảng 4.2: Độ hữu hiệu (%) của chế phẩm vi rút NPV đối với SAT sau khi sản xuất 3 tháng trong điều kiện phòng thí nghiệm.

T: 30,5ºC, RH: 84%

Nghiệm thức Độ hữu hiệu (%) qua các ngày sau khi chủng

3 5 7 9 12 Lỏng (250C) 7,4 35,4b 59,7b 78,8bc 89,7b Lỏng (40C) 10,6 54,0b 75,1b 90,0ab 92,5b Khô (250C) 19,8 55,1b 70,7b 76,2c 77,5c Khô (40C) 19,2 51,4b 75,3b 78,0bc 89,0b Vi rút (tinh khiết) 34,5 90,9a 100,0a 100,0a 100,0a CV (%) 72,0 25,8 19,0 15,8 14,5 F ns ** ** ** **

Kết quả thí nghiệm (Bảng 4.2) về đánh giá hiệu quả của các dạng chế phẩm vi rút NPV trong phòng trị SAT tuổi 2 tại điều kiện phòng thí nghiệm cho thấy tất cả các nghiệm thức đều có hiệu quả đối với SAT, dao động từ 7,4 đến 34,5% sau 3 ngày chủng nhiễm. Tuy nhiên sự khác biệt này lại không có ý nghĩa qua phân tích thống kê.

Đến thời điểm 5 và 7 ngày sau khi chủng nhiễm, qua phân tích số liệu thống kê cho thấy độ hữu hiệu của các nghiệm thức tiếp tục tăng, dao động từ 34,5 đến 90,9% (5 NSKC) và 59,7% đến 100% (7 NSKC). Nghiệm thức cho hiệu quả cao nhất là nghiệm thức vi rút tinh khiết đã cho hiệu lực gây chết SAT đạt 90,9% sau 5 ngày chủng nhiễm và đạt hiệu quả tối đa vào thời điểm 7 NSKC và khác biệt hoàn toàn so với các nghiệm thức còn lại. Qua phân tích thông kê ở mức ý nghĩa 1%. Trong khi đó hiệu quả giữa các dạng chế phẩm và điều kiện bảo quản lại không khác biệt nhau qua phân tích thống kê. Tương tự như mới sản xuất các dạng chế phẩm cần một thời gian nhất định từ 2 – 4 ngày để vi rút xâm nhập và phát triển trong cơ thể sâu non và cần thời gian để vi rút nhân mật số nhất định, khi đã nhân đủ mật số thì sẽ giết chết côn trùng một cách nhanh chóng sau đó 2 – 3 ngày.

Tại thời điểm 9 ngày cho thấy nghiệm thức chế phẩm lỏng bảo quản điều kiện 40C (90,0%) đã tỏ ra ưu thế hơn các nghiệm thức còn lại là khô (40

C), khô (250C), lỏng (250C) đạt hiệu quả lần lượt là: 78,0%, 76,2%, 78,8% thể

hiện sự khác biệt ở mức ý nghĩa 1%. Kết quả nghiên cứu này cũng phù hợp với các nghiên cứu trước đó của Trịnh Thị Xuân (2011); Vương Bích Vân (2010); Trần Thị Ánh Tuyết (2009); Phạm Thị Thùy (2004) khi xử lý vi rút tinh khiết với nồng độ 108 OBs/ml đối với sâu ăn tạp tuổi 2 trong điều kiện phòng thí nghiệm sau 9 ngày xử lý thì cho hiệu quả dao động từ 92,6 đến 100%.

Sau 12 ngày thí nghiệm các nghiệm thức cho hiệu quả cao, kéo dài. Đây cũng là một ưu điểm của các sản phẩm vi sinh vì sau một thời gian tích lũy mật số trong cơ thể sẽ được nhân lên và phá hủy toàn bộ hệ thống tiêu hóa của sâu làm sâu chết hàng loạt sau thời gian ủ bệnh từ 4 đến 10 ngày (Trịnh Thị Xuân, 2011). Nghiệm thức cho hiệu quả cao với SAT tuổi 2 vẫn là nghiệm thức vi rút tinh khiết đã có số sâu chết hoàn toàn (tương đương độ hữu hiệu 100%), còn nghiệm thức khô (250C) vẫn là nghiệm thức cho hiệu quả thấp nhất đạt 77,5%, sự khác biệt so với các nghiệm thức khác được thể hiện qua phân tích thống kê ở mức ý nghĩa 1%. Vì theo Sapiro và Robertson (1990) cho rằng vi rút NPV sẽ bị mất hoạt tính khi bị chiếu sáng với bước sóng 230 - 280nm và ở nhiệt độ thường vi rút NPV rất dễ bị biến tính, mất hiệu lực.

4.3 Hiệu lực của chế phẩm vi rút NPV sau 5 tháng sản xuất

Kết quả ở Bảng 4.3 cho thấy hiệu lực của các nghiệm thức vi rút NPV đã giảm sau 5 tháng sản xuất.

Bảng 4.3: Độ hữu hiệu (%) của chế phẩm vi rút NPV đối với sâu ăn tạp sau 5 tháng sản xuất trong điều kiện phòng thí nghiệm.

T: 29ºC, RH: 78%

Nghiệm thức Độ hữu hiệu (%) qua các ngày sau khi chủng

3 5 7 9 12 Lỏng (250C) 5,2b 25,6c 31,1c 33,1c 34,4c Lỏng (40C) 13,5b 48,6b 57,9b 60,5b 64,8b Khô (250C) 5,2b 52,1b 65,8b 67,1b 70,1b Khô (40C) 8,3b 48,9b 68,8b 72,8b 74,6b Vi rút (tinh khiết) 40,6a 92,5a 100,0a 100,0a 100,0a CV (%) 34,7 17,1 12,7 12,0 11,4 F ** ** ** ** **

Các số trong cùng một cột có chữ theo sau giống nhau thì không khác biệt có ý nghĩa thống kê.ns: không khác biệt qua phân tích thống kê; *: khác biệt ở mức ý nghĩa 5%; **: khác biệt ở mức ý nghĩa 1%

Tại thời điểm 3 ngày sau khi chủng thức ăn đã có sự khác biệt giữa nghiệm thức vi rút tinh khiết với các dạng chế phẩm qua phân tích thống kê với mức ý nghĩa 1%. Vi rút tinh khiết cho hiệu lực cao nhất đạt 40,6%, các dạng chế phẩm chỉ đạt từ 5,2 đến 13,2% và không có sự khác biệt giữa các nghiệm thức này.

Xét ở thời điểm 5 ngày sau khi chủng nhiễm cho thấy nghiệm thức vi rút tinh khiết cho hiệu quả cao nhất đạt 92,5% và khác biệt hoàn toàn với các nghiệm thức còn lại ở mức ý nghĩa 1%, Cũng ở thời điểm này cho thấy nghiệm thức vi rút chế phẩm khô (250C) cho hiệu quả diệt sâu ăn tạp trên 50%, tuy nhiên khác biệt này không ý nghĩa so với các dạng chế phẩm còn lại. Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Trịnh Thị Xuân (2011) khi cho rằng ở thời điểm 5 ngày sau khi chủng nhiễm chế phẩm vi rút cho hiệu quả diệt sâu ăn tạp đạt 50%.

Ở các thời điểm 7, 9 và 12 NSKC hiệu lực đã có sự gia tăng. Vi rút tinh khiết vẫn cho hiệu quả cao đối với SAT là 100%. Đối với các dạng chế phẩm tuy hiệu lực của vi rút có tăng dần và thể hiên sự khác biệt giữa dạng chế phẩm lỏng 250C với các dạng chế phẩm còn lại qua phân tích thống kê ở mức ý nghĩa 1%. Qua phân tích số liệu thống kê cho thấy có sự khác biệt rõ ràng trong các điều kiện bảo quản. Chế phẩm vi rút được bảo quản ở 250C (25,7 đến 34,4%) có hiệu lực thấp hơn chế phẩm được bảo quản ở 40 (48,6 đến

64,8%) kết quả có sự khác biệt qua phân tích thống kê ở mức ý nghĩa 1%. Theo Trịnh Thị Xuân (2011) cũng cho rằng sau thời gian 5 tháng bảo quản trong điều kiện bình thường thì có một số thể vùi của vi rút sẽ bị chết hoặc bị giảm hiệu lực, vì vậy sẽ mang lại hiệu quả chậm và thấp.

4.4 Hiệu lực của hai dạng chế phẩm vi rút NPV sau 8 tháng sản xuất

Kết quả ở Bảng 4.4 cho thấy các dạng chế phẩm vi rút NPV sau 8 tháng bảo quản ở các điều kiện khác nhau đã có sự khác biệt rõ rệt qua phân tích thống kê.

Bảng 4.4: Độ hữu hiệu (%) của chế phẩm vi rút NPV đối với sâu ăn tạp sau 8 tháng xuất sản trong điều kiện phòng thí nghiệm.

T: 30ºC, RH: 76%

Nghiệm thức Độ hữu hiệu (%) qua các ngày sau khi chủng

3 5 7 9 12 Lỏng (250C) 2,1 3,2b 9,8b 21,7c 23,9c Lỏng (40C) 3,1 15,0ab 32,7ab 41,7b 53,3b Khô (250C) 1,0 3,4b 15,8b 21,0c 29,2c Khô (40C) 3,1 13,9ab 30,4ab 52,8b 66,8b Vi rút (tinh khiết) 6,3 21,8a 86,4a 98,3a 100a CV (%) 66,4 54,0 42,2 26,9 19,3 F ns * * * *

Áp dụng phương pháp lây nhiễm qua thức ăn, sau 3 ngày ghi nhận hiệu quả của các nghiệm thức dao động từ 1,0% - 6,3%, tuy nhiên giữa các nghiệm thức không có sự khác biệt nhau qua phân tích thống kê.

Đến thời điểm 5 và 7 ngày sau khi chủng thức ăn, hiệu lực của các dạng chế phẩm tiếp tục tăng. Đạt hiệu quả cao nhất ở 2 thời điểm trên là vi rút tinh khiết với hiệu lực lần lượt là: 21,8%; 86,4% kế đến là nghiệm thức chế phẩm khô (40C), lỏng (40C) không khác biệt qua phân tích thống kê, nhưng khác biệt hoàn toàn so với chế phẩm dạng lỏng (250C) và khô (250C)ở mức ý nghĩa 5%.

Sản xuất chế phẩm NPV trên thế giới

Quy trình sản xuất chế phẩm