dịch hại
2.4.1 Ƣu điểm của chế phẩm NPV
Theo Boguslaw et al. (2009), Baculovirus chỉ gây bệnh cho duy nhất ngành chân khớp mà không làm ảnh hưởng đến động vật có xương sống, cây trồng và các vi sinh vật khác. Tuy nhiên trong điều kiện đặc biệt thuận lợi nào đó thì chúng có thể xâm nhập vào trong tế bào của động vật mặc dù chúng sẽ bị bất hoạt ngay liền sau khi xâm nhập. Điều này có nghĩa là Baculovirus không làm ô nhiễm môi trường sống, chúng ta không cần phải quan tâm đến vấn đề ngộ độc thuốc hay lưu tồn… như khi sử dụng thuốc hóa học.
Ưu điểm nổi bật thứ hai của Baculovirus là chúng có tính chọn lọc ký chủ rất cao so với các nhóm vi rút thiên địch khác (Frances et al., 1998) do đó mà không làm hại đến các loài côn trùng có ích khác như thuốc hóa học.
Baculovirus có cấu trúc với thể bọc bảo vệ, tránh các yếu tố bất lợi của môi trường nên có thể duy trì khả năng sống trong tự nhiên ngoài cơ thể vật chủ (Phạm Văn Ty và Vũ Nguyên Thành, 2007).
Cũng theo Phạm Văn Ty và Vũ Nguyên Thành (2007) thì Baculovirus rất thuận lợi khi sản xuất chế phẩm thương mại vì thường có thể đạt nồng độ cao trong mô của ấu trùng (1010 OBs/ấu trùng). Chế phẩm có thể giữ hoạt tính trong thời gian rất dài (10 - 15 năm) ngoài cơ thể côn trùng.
18
2.4.2 Nhƣợc điểm của chế phẩm NPV
Chế phẩm vi rút rất khó bảo quản, chúng đòi hỏi điều kiện môi trường phải thích hợp để giữ chúng ở trạng thái nghỉ, đồng thời sản phẩm rất dễ bị nhiễm vi khuẩn gây thối (Hoàng Thị Việt, 2000).
So với thuốc hóa học thì hiệu lực trừ sâu của vi rút chậm hơn nhiều (Fuxa, 1992). Nông dân muốn rằng sau khi phun thuốc thì sâu phải bị tiêu diệt ngay do đó chế phẩm vi rút chưa được người dân ưa thích sử dụng.
Ngoài ra chế phẩm vi rút còn gặp khó khăn về vấn đề thương mại. Do Baculovirus rất đặc hiệu đối với ký chủ, mà thường trên cùng một mùa vụ có nhiều loài dịch hại cùng xuất hiện, sẽ rất tốn kém nếu phải dùng mỗi loại thuốc cho một loài dịch hại riêng biệt. Hơn nữa việc sản xuất chế phẩm vi rút cũng khó khăn hơn thuốc hóa học vì vi rút phải được nuôi từ cơ thể sống, chúng không thể phát triển trong môi trường nhân tạo do đó giá thành sản phẩm sẽ tăng lên (Trần Văn Mão, 2002).
2.4.3 Các chất phụ gia
Một trong những bất lợi của việc sử dụng nhóm tác nhân sinh học trong phòng trừ sâu hại chúng dễ bị mất hoạt tính khi bị chiếu sáng trực tiếp ngoài môi trường. Tia UV-B (280 - 320 nm) được xem là tia gây bất hoạt các vi sinh vật (Jones and McKinley, 1986) làm cho chúng mất 50% khả năng gây bệnh trong vài ngày (Ignoffo et al., 1977) hoặc trong vòng 24 giờ (Broome et al., 1974). Một trong những phương pháp được sử dụng để làm giảm tác động của tia UV-B là thêm vào chất chống lại tia UV như chất nhuộm và chất tẩy trắng quang học (Shapiro và Robertson, 1990).
Trong những năm gần đây, bằng nhiều nổ lực của các nhà khoa học trên thế giới đã tìm ra được những phương pháp giúp nâng cao hiệu quả sử dụng của vi rút bằng cách gia tăng tính mẫn nhiễm của ký chủ với một số hóa chất được chọn (Mukawa et al., 2003). Theo Mehrvar et al. (2008) thì việc thêm một số chất phụ gia góp phần nâng cao hiệu lực của vi rút bằng với việc sử dụng tăng gấp đôi lượng vi rút.
19
CHƢƠNG 2
PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian: đề tài được tiến hành từ tháng 12/2012 đến tháng 11/2013
Địa điểm: đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm phát triển chế phẩm sinh học (NEDO), Bộ môn Bảo vệ Thực vật (BVTV), Khoa Nông Nghiệp và Sinh học Ứng Dụng, Trường Đại học Cần Thơ.
3.2 Phƣơng tiện
- Sâu sạch (tuổi 2): SAT được thu ngoài đồng nuôi trong điều kiện phòng thí nghiệm với thức ăn nhân tạo được nghiên cứu là tốt nhất cho sự phát triển của sâu do Bộ môn BVTV sản xuất (Trần Thị Thuỳ Dung, 2008), nuôi SAT trong hộp nhựa (10 x 20 x 20 cm). Khi sâu hóa nhộng và vũ hóa sẽ được chuyển sang bọc giấy có bổ sung 3% nước đường để bướm đẻ trứng, cắt những ổ trứng và khử bằng formalin 3% sau đó rửa ổ trứng qua nước sạch, làm khô ráo các ổ trứng này và để trứng vào trong hộp nhựa (70 ml) đến khi trứng nở sâu non. Tuy nhiên, để loại bỏ tác nhân nguyên sinh động vật (protozoa) thì sẽ tiến hành kiểm tra bướm bố mẹ để loại bỏ những ổ trứng có bướm bố mẹ nhiễm nguyên sinh động vật nhằm thu được các thế hệ sâu non sạch bệnh.
Hình 3.1: Nhân nuôi sâu sạch trong phòng thí nhiệm
- Nguồn vi rút: chủng vi rút SpltNPV kế thừa kết quả thí nghiệm của Trịnh Thị Xuân (2011); Vương Bích Vân (2010) bảo quản ở điều kiện lạnh (40C).
20
- Sản xuất chế phẩm:
Dạng lỏng: Vi rút NPV (107OBs/ml) + 20% Glycerin+ 1% Boric acid. Dạng bột: Vi rút NPV (107OBs/ml) + 20% Glycerin+ 1% Boric acid + 50% than hoạt tính.
Đối với dạng bột sau khi phối trộn sẽ đợi cho than hoạt tính hấp thụ vi rút NPV, sau đó sấy khô trong tủ sấy (Sanyo MOV-121F) ở nhiệt độ 26 - 290C với thời gian là 18 giờ. Sau khi phối trộn được hai dạng lỏng và bột sẽ tồn trữ ở 40C và điều kiện nhiệt độ phòng.
- Hóa chất: chất phụ gia (acid boric), glycerin, chất hút ẩm (than hoạt tính), chlorine.
- Vật liệu: hộp nuôi sâu, thức ăn nhân tạo, giấy lót, beaker, bình tam giác, nước cất, giấy thấm, kẹp inox, cọ lông, kéo, keo dán, bút lông, lame đếm Thoma, lamell, pipette, cồn 70% để khử trùng dụng cụ, bọc giấy, đồng hồ đo nhiệt độ ẩm độ…
- Các loại thiết bị: kính hiển vi huỳnh quang, máy Vortex, máy ly tâm lạnh, máy thanh trùng, tủ lạnh 40C, cân điện tử…
3.3 Phƣơng pháp
- Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên với 6 nghiệm thức trong đó 5 nghiệm thức là các dạng chế phẩm vi rút và nghiệm thức đối chứng (sử dụng nước cất thanh trùng), mỗi nghiệm thức có 4 lần lập lại, mỗi lần lập lại gồm 24 ấu trùng SAT tuổi 2 (trước khi bố trí thí nghiệm cần bỏ đói SAT trước 12 giờ). Sử dụng phương pháp lây nhiễm qua thức ăn (Shorey và Hale, 1965), nhỏ 10µl dung dịch vi rút vào thức ăn nhân tạo (đường kính 6 mm, dầy 3 mm), trộn lẫn vi rút vào thức ăn và cho vào khuôn
Hình 3.2: Chế phẩm SpltNPV dạng khô
Hình 3.3: Chế phẩm SpltNPV dạng lỏng
21
chủng Test plate (đường kính 30 mm), chuyển từng cá thể sâu vào khuôn chủng (1 khuôn có 24 ô). Sau 2 ngày sẽ chuyển sâu từ khuôn chủng ra từng hộp nhỏ (30 ml) để theo dõi quan sát hàng ngày.
- Thí nghiệm được thực hiện sau 1, 3, 5, 8 và 12 tháng sau khi sản xuất bảo quản ở hai điều kiện (40C và 250C) sau khi sản xuất.
- Các chỉ tiêu theo dõi:
Triệu chứng: ghi nhận triệu chứng gây chết của các chủng vi rút đối SAT. Ở các thời điểm 3, 5, 7, 9, 12 ngày sau khi chủng.
Độ hữu hiệu: Tính bằng công thức Abbott, 1925. C - T
ĐHH (%) = --- x 100 C
C: số sâu còn sống ở nghiệm thức đối chứng T: số sâu còn sống ở nghiệm thức chủng vi rút
Xử lý số liệu bằng phần mềm Excel, thống kê số liệu bằng chương trình MSTATC.
22
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ THẢO LUẬN
4.1 Hiệu lực của chế phẩm vi rút NPV sau 1 tháng sản xuất
Qua kết quả thí nghiệm Bảng 4.1 cho thấy 2 dạng chế phẩm lỏng và khô được bảo quản trong điều kiện 40
C và 250C đều có hiệu quả đối với SAT tuổi 2 ở mọi thời điểm quan sát.
Bảng 4.1: Độ hữu hiệu của chế phẩm vi rút NPV đối với SAT sau khi sản xuất 1 tháng trong điều kiện phòng thí nghiệm.
T: 29,5ºC, RH: 80%
Nghiệm thức Độ hữu hiệu (%) qua các ngày sau khi chủng
3 5 7 9 12 Lỏng (250C) 4,3 18,6b 58,3b 88,5b 91,9 Lỏng (40C) 10,6 40,7b 78,0ab 90,2b 90,2 Khô (250C) 5,4 25,5b 77,1b 84,6b 88,9 Khô (40C) 7,6 34,4b 81,3ab 86,6b 89,9 Vi rút (tinh khiết) 10,9 86,9a 97,8a 100,0a 100,0 CV (%) 43,2 23,6 18,7 13,2 11,1 F ns ** ** ** ns
Các số trong cùng một cột có chữ theo sau giống nhau thì không khác biệt có ý nghĩa thống kê. ns: không khác biệt qua phân tích thống kê; *: khác biệt ở mức ý nghĩa 5%; **: khác biệt ở mức ý nghĩa 1%
Ở thời điểm 3 ngày sau khi chủng vi rút vào thức ăn cho thấy nghiệm thức bảo quản điều kiện 40C của cả 2 dạng chế phẩm lỏng và khô cho hiệu quả cao hơn các nghiệm thức còn lại tuy nhiên sự khác biệt này không có ý nghĩa qua phân tích thống kê.
Quan sát và ghi nhận chỉ tiêu sau 5 ngày cho ăn cho thấy hiệu lực của các dạng vi rút tăng cao. Hiệu quả cao nhất đó là vi rút tinh khiết (vi rút thuần) có độ hữu hiệu là 86,9% khác biệt hoàn toàn qua phân tích thống kê ở mức ý nghĩa 1% so với các nghiệm thức còn lại. So sánh các nghiệm thức còn lại cho thấy chế phẩm vi rút ở dạng lỏng và dạng khô được bảo quản ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau đều có hiệu quả đối với SAT, tuy nhiên giữa các nghiệm thức này lại không có sự khác biệt nhau qua phân tích thống kê. Điều này có thể lý giải là do chế phẩm vi rút NPV mới sản xuất một tháng nên mặc dù
23
được trữ ở hai điều kiện khác nhau nhưng vẫn cho hiệu quả tương đương nhau, chế phẩm chưa bị mất hoạt lực bởi các yếu tố như nhiệt độ, ẩm độ bên ngoài.
Đến ngày thứ 7 sau khi chủng cho thấy các nghiệm thức có sự khác biệt qua phân tích thống kê ở mức ý nghĩa 1%. Trong đó nghiệm thức có độ hữu hiệu cao nhất là nghiệm thức sử dụng vi rút tinh khiết (97,8%) và không khác biệt ở mức ý nghĩa 1% khi so với chế phẩm vi rút ở dạng lỏng và khô trong điều kiện tồn trừ 40C (lần lượt là 78,0 và 81,3 %) nhưng khác biệt so với 2 nghiệm thức còn lại là chế phẩm vi rút lỏng và khô khi tồn trữ ở điều kiện nhiệt độ 250C lần lượt đạt 58,3%; 77,1 %. Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Trịnh Thị Xuân (2011) khi cho rằng chế phẩm vi rút NPV sau khi sản xuất 1 tháng ở dạng khô sẽ có hiệu quả từ 50 – 80% tại thời điểm 7 ngày sau khi chủng khi đánh giá trên SAT.
Hiệu lực của chế phẩm vi rút NPV càng thể hiện rõ sau 9 ngày, trong đó nghiệm thức vi rút tinh khiết đạt hiệu quả đạt cao nhất (100%) và khác biệt so với các dạng chế phẩm lỏng và khô được bảo quản ở các điều kiện khác nhau ở mức ý nghĩa 1% qua phân tích thống kê. Trong khi đó, các nghiệm thức chế phẩm vi rút tuy có sự khác biệt nhau nhưng sự khác biệt này lại không có ý nghĩa qua phân tích thống kê.
Theo dõi ngày tiếp theo 12 ngày sau khi chủng thức ăn cho thấy hiệu lực củacác nghiệm thức không khác biệt qua phân tích thống kê và cho hiệu lực tương đương nhau.
4.2 Hiệu lực của hai dạng chế phẩm vi rút NPV sau 3 tháng sản xuất
Từ kết quả Bảng 4.2 cho thấy hiệu quả sản phẩm vi rút sau 3 tháng sản xuất tại bộ môn Bảo Vệ Thực Vật vẫn cho hiệu lực cao đối với SAT.
24
Bảng 4.2: Độ hữu hiệu (%) của chế phẩm vi rút NPV đối với SAT sau khi sản xuất 3 tháng trong điều kiện phòng thí nghiệm.
T: 30,5ºC, RH: 84%
Nghiệm thức Độ hữu hiệu (%) qua các ngày sau khi chủng
3 5 7 9 12 Lỏng (250C) 7,4 35,4b 59,7b 78,8bc 89,7b Lỏng (40C) 10,6 54,0b 75,1b 90,0ab 92,5b Khô (250C) 19,8 55,1b 70,7b 76,2c 77,5c Khô (40C) 19,2 51,4b 75,3b 78,0bc 89,0b Vi rút (tinh khiết) 34,5 90,9a 100,0a 100,0a 100,0a CV (%) 72,0 25,8 19,0 15,8 14,5 F ns ** ** ** **
Các số trong cùng một cột có chữ theo sau giống nhau thì không khác biệt có ý nghĩa thống kê. ns: không khác biệt qua phân tích thống kê; *: khác biệt ở mức ý nghĩa 5%; **: khác biệt ở mức ý nghĩa 1%
Kết quả thí nghiệm (Bảng 4.2) về đánh giá hiệu quả của các dạng chế phẩm vi rút NPV trong phòng trị SAT tuổi 2 tại điều kiện phòng thí nghiệm cho thấy tất cả các nghiệm thức đều có hiệu quả đối với SAT, dao động từ 7,4 đến 34,5% sau 3 ngày chủng nhiễm. Tuy nhiên sự khác biệt này lại không có ý nghĩa qua phân tích thống kê.
Đến thời điểm 5 và 7 ngày sau khi chủng nhiễm, qua phân tích số liệu thống kê cho thấy độ hữu hiệu của các nghiệm thức tiếp tục tăng, dao động từ 34,5 đến 90,9% (5 NSKC) và 59,7% đến 100% (7 NSKC). Nghiệm thức cho hiệu quả cao nhất là nghiệm thức vi rút tinh khiết đã cho hiệu lực gây chết SAT đạt 90,9% sau 5 ngày chủng nhiễm và đạt hiệu quả tối đa vào thời điểm 7 NSKC và khác biệt hoàn toàn so với các nghiệm thức còn lại. Qua phân tích thông kê ở mức ý nghĩa 1%. Trong khi đó hiệu quả giữa các dạng chế phẩm và điều kiện bảo quản lại không khác biệt nhau qua phân tích thống kê. Tương tự như mới sản xuất các dạng chế phẩm cần một thời gian nhất định từ 2 – 4 ngày để vi rút xâm nhập và phát triển trong cơ thể sâu non và cần thời gian để vi rút nhân mật số nhất định, khi đã nhân đủ mật số thì sẽ giết chết côn trùng một cách nhanh chóng sau đó 2 – 3 ngày.
Tại thời điểm 9 ngày cho thấy nghiệm thức chế phẩm lỏng bảo quản điều kiện 40C (90,0%) đã tỏ ra ưu thế hơn các nghiệm thức còn lại là khô (40
C), khô (250C), lỏng (250C) đạt hiệu quả lần lượt là: 78,0%, 76,2%, 78,8% thể
25
hiện sự khác biệt ở mức ý nghĩa 1%. Kết quả nghiên cứu này cũng phù hợp với các nghiên cứu trước đó của Trịnh Thị Xuân (2011); Vương Bích Vân (2010); Trần Thị Ánh Tuyết (2009); Phạm Thị Thùy (2004) khi xử lý vi rút tinh khiết với nồng độ 108 OBs/ml đối với sâu ăn tạp tuổi 2 trong điều kiện phòng thí nghiệm sau 9 ngày xử lý thì cho hiệu quả dao động từ 92,6 đến 100%.
Sau 12 ngày thí nghiệm các nghiệm thức cho hiệu quả cao, kéo dài. Đây cũng là một ưu điểm của các sản phẩm vi sinh vì sau một thời gian tích lũy mật số trong cơ thể sẽ được nhân lên và phá hủy toàn bộ hệ thống tiêu hóa của sâu làm sâu chết hàng loạt sau thời gian ủ bệnh từ 4 đến 10 ngày (Trịnh Thị Xuân, 2011). Nghiệm thức cho hiệu quả cao với SAT tuổi 2 vẫn là nghiệm thức vi rút tinh khiết đã có số sâu chết hoàn toàn (tương đương độ hữu hiệu 100%), còn nghiệm thức khô (250C) vẫn là nghiệm thức cho hiệu quả thấp nhất đạt 77,5%, sự khác biệt so với các nghiệm thức khác được thể hiện qua phân tích thống kê ở mức ý nghĩa 1%. Vì theo Sapiro và Robertson (1990) cho rằng vi rút NPV sẽ bị mất hoạt tính khi bị chiếu sáng với bước sóng 230 - 280nm và ở nhiệt độ thường vi rút NPV rất dễ bị biến tính, mất hiệu lực.
4.3 Hiệu lực của chế phẩm vi rút NPV sau 5 tháng sản xuất
Kết quả ở Bảng 4.3 cho thấy hiệu lực của các nghiệm thức vi rút NPV đã giảm sau 5 tháng sản xuất.
26
Bảng 4.3: Độ hữu hiệu (%) của chế phẩm vi rút NPV đối với sâu ăn tạp sau 5 tháng sản xuất trong điều kiện phòng thí nghiệm.
T: 29ºC, RH: 78%
Nghiệm thức Độ hữu hiệu (%) qua các ngày sau khi chủng
3 5 7 9 12 Lỏng (250C) 5,2b 25,6c 31,1c 33,1c 34,4c Lỏng (40C) 13,5b 48,6b 57,9b 60,5b 64,8b Khô (250C) 5,2b 52,1b 65,8b 67,1b 70,1b Khô (40C) 8,3b 48,9b 68,8b 72,8b 74,6b Vi rút (tinh khiết) 40,6a 92,5a 100,0a 100,0a 100,0a CV (%) 34,7 17,1 12,7 12,0 11,4 F ** ** ** ** **
Các số trong cùng một cột có chữ theo sau giống nhau thì không khác biệt có ý nghĩa thống kê.ns: không khác biệt qua phân tích thống kê; *: khác biệt ở mức ý nghĩa 5%; **: khác biệt ở mức ý nghĩa 1%
Tại thời điểm 3 ngày sau khi chủng thức ăn đã có sự khác biệt giữa nghiệm thức vi rút tinh khiết với các dạng chế phẩm qua phân tích thống kê