* Mục đích
Xác định vi khuẩn hiếu khí hoặc kỵ khí.
* Cách tiến hành
Cấy vi khuẩn vào môi trường phân lập đĩa, nuôi ở 30oC trong 48 giờ để khuẩn lạc
vi khuẩn phát triển đầy đủ. Nhỏ 3 giọt H2O2 3% lên khuẩn lạc của vi khuẩn.
* Ghi nhận kết quả
Nếu sủi bọt là dương tính tức có khả năng sinh catalase, không có sủi bọt là âm tính tức không có khả năng sinh catalase. Hoạt tính catalase được đánh giá +, ++ hay +++.
3.2.6. Kiểm tra Methyl red * Mục đích * Mục đích
Xác định khả năng sinh acid của vi khuẩn trong môi trường.
* Cách tiến hành
Chủng vi khuẩn vào môi trường môi trường glucose-phosphate, ủ ở 30oC trên
máy lắc (120vòng/phút) trong 72-96giờ. Sau đó trộn đều bằng máy vortex và nhỏ 5 giọt thuốc thử Methyl red vào. Đối chứng là môi trường glucose-phosphate không có vi khuẩn.
* Quan sát kết quả
Nếu dương tính thì dung dịch có màu đỏ nhạt tức có sinh acid trong môi trường, còn âm tính thì dung dịch có màu vàng hoặc cam tức không sinh acid trong môi trường.
3.2.7. Thí nghiệm kiểm tra hoạt tính amylase (Nguyễn Lân Dũng, 2006) * Mục đích * Mục đích
Chọn ra những dòng vi khuẩn có hoạt tính amylase.
* Bố trí thí nghiệm
Mỗi dòng vi khuẩn là một nghiệm thức với 3 lần lặp lại. VD2 được dùng như đối
chứng dương (có hoạt tính amylase) và môi trường LB là đối chứng âm (không có hoạt tính amylase).
* Cách tiến hành
Đục lỗ và làm mới vi khuẩn:
- Dùng đầu côn thủy tinh để đục lỗ (đường kính 4 mm) trên đĩa môi trường kiểm tra hoạt tính amylase (Hình 15). Không để đầu côn chạm đáy đĩa petri. Sau đó úp
ngược, cho vào túi nylon buộc miệng, trữ qua đêm trong tủ ủ 30oC để loại bỏ những
đĩa bị nhiễm vi sinh vật từ môi trường bên ngoài.
- Dùng kim cấy đã khử trùng lấy một ít vi khuẩn trong ống ròng chủng vào môi
trường lỏng LB, đem ủ ở 30o
C trong 24 giờ để vi khuẩn sinh trưởng đến pha Log.
Hình 13: Vị trí các giếng trên môi trƣờng kiểm tra hoạt tính amylase
Chủng vi khuẩn vào giếng:
- Trộn đều vi khuẩn bằng máy vortex, dùng miropipet hút 20µl vi khuẩn và các
đối chứng cho vào các lỗ đục, đậy nấp đĩa, đem ủ ở 30o
C trong 96 giờ. Khi cho vào lỗ đục tránh không cho các giọt vi khuẩn rơi rớt hay tràn ra ngoài.
Nhỏ dung dịch Lugol:
- Trán đều dung dịch Lugol trên mặt môi trường của đĩa vi khuẩn, chờ phản ứng. Vùng tinh bột bị phân hủy xung quanh khuẩn lạc sẽ có màu sáng rõ vì không bắt màu với Lugol.
- Ghi nhận kết quả: đối chứng dương, đối chứng âm, đường kính khuẩn lạc (d), đường kính trung bình vòng halo (D), và chụp hình làm bằng chứng. Dương tính khi D/d >1, ngược lại là âm tính. Trong số những kết quả dương tính, chọn ra 2 dòng vi khuẩn có hoạt tính amylase mạnh nhất để khảo sát sự tăng trưởng của vi khuẩn theo thời gian và giải trình tự.
3.2.8. Sự tăng trƣởng của vi khuẩn theo thời gian * Mục đích
Xác định ảnh hưởng của mật số ban đầu đến sự sinh trưởng của vi khuẩn. Đồng thời xác định tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn. Tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn được xác định bởi công thức (Nguyễn Lân Dũng, 2006):
k = n/t
Trong đó:
k là tốc độ sinh trưởng (lần/giờ),
n là hệ số thế hệ (lần),
t là thời gian nuôi cấy (giờ).
Tốc độ sinh trưởng k càng lớn thì vi khuẩn sinh trường càng nhanh. Để tính được
k ta cần có n. Để tìm n, ta dựa vào mật số vi khuẩn trước (N0)và sau nuôi cấy (Nt). Cụ
thể ta dùng công thức sau:
Nt = N0.2n . Suy ra n = (logNt – logN0)/log2
Trong đó:
n là hệ số thế hệ (lần),
N0: là mật số ban đầu của vi khuẩn (số vi khuẩn/ml),
Nt: là mật số của vi khuẩn sau t giờ nuôi cấy (số vi khuẩn/ml).
* Bố trí thí nghiệm Bảng 2: Bố trí thí nghiệm xác định mật số vi khuẩn Nghiệm thức Lặp lại Mật số ban đầu (N0) Mật số sau 12 giờ nuôi (N12) Mật số sau 24 giờ nuôi (N24) Mật số sau 36 giờ nuôi (N36) VK1 Pha loãng 1 3 Pha loãng 2 Pha loãng 3 VK2 Pha loãng 1 3 Pha loãng 2 Pha loãng 3
* Cách tiến hành
- Vi khuẩn được nuôi trong môi trường LB ở nhiệt độ 30oC trong 24 giờ. Mật số ban đầu được xác định tại thời điểm vi khuẩn vừa được chủng vào môi trường LB.
- Pha loãng dung dịch chứa vi khuẩn đến các với các độ pha loãng khác nhau. Sau khi pha loãng dùng micropipette hút 5l dung dịch nhỏ vào đĩa petri chứa môi trường tinh bột đĩa (lặp lại 3 lần). Ủ vi khuẩn ở tủ ủ 30o
C trong 24 giờ.
* Ghi nhận kết quả
Đếm số khuẩn lạc xuất hiện trong đĩa sau khi nuôi ở từng độ pha loãng khác nhau và tính mật số vi sinh vật trong một đơn vị thể tích theo công thức:
Mật số (CFU/ml) = CFU x 1000 x độ pha loãng/5 CFU: số khuẩn lạc trung bình đếm được.
3.2.9. Khuếch đại vùng gene 16S rRNA * Mục đích * Mục đích
Khuếch đại vùng gene 16S rRNA của vi khuẩn đến một lượng cần thiết vừa đủ để diện di trên gel agarose và giải trình tự.
* Cách tiến hành
Quy trình ly trích DNA từ khuẩn lạc ròng
- Chọn 10 khuẩn lạc ròng cho vào tube eppendof 2,2ml. - Cho 1 viên bi sắt vào tube và lắc bằng máy lắc.
- Cho vào 1ml Lysis buffer, lắc đều, ủ ở nhiệt độ phòng trong 10phút. - Ly tâm 13000rpm/5phút, lấy phần dung dịch chuyển sang tube mới.
- Cho một lượng tương đương ethanol 95%, đảo nhẹ các ống tube, ủ 10phút ở nhiệt độ phòng sau đó ly tâm 13000 rpm/5phút, bỏ phần dung dịch phía trên.
- Rửa phần tủa bằng 500 µl ethanol 70%, ly tâm 13000 rpm/5phút. - Sấy khô chân không trong 10 phút.
- Hòa tan trong 100 µl TE 0,1X. - Trữ ở -20 oC.
Phản ứng khuếch đại DNA
- Khuếch đại DNA bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi27F-1492R (Lane, 1991): 27F- 5’-AGAGTTTAGTCCTTGGCTCAG- 3’
- Sau khi ly trích nhanh DNA của những dòng vi khuẩn được tuyển chọn, tiến hành PCR bằng máy PCR Perkin Elmer PE 9700 (Hoa Kỳ) với hai đoạn mồi nêu trên.
Bảng 3: Thành phần các chất trong một phản ứng PCR Thành phần 1 phản ứng (µl) Nước cất 2 lần 12,5 Buffer 10X 2,5 MgCl2 25mM 2 dNTP 4 Mồi xuôi 8F 1 Mồi ngược 1492R 1 Taq DNA po ymerase 0,25 DNA vi khuẩn 2 Tổng thể tích 25
- Phản ứng PCR gồm có các giai đoạn như sau:
Bảng 4: Các giai đoạn của phản ứng PCR Giai đoạn Tên giai đoạn Chu kỳ Nhiệt độ (oC) Thời gian
1 Biến tính 95oC 5 phút
2 Biến tính 95oC 30 giây
Bắt cặp 38 55oC 30 giây
Kéo dài 72oC 5 phút
3 Kéo dài 72oC 10 phút
- Sản phẩm PCR sẽ được dùng để diện di trên gel agarose 1,5% và gửi giải trình tự ở Hàn Quốc.
* Điện di sản phẩm PCR trên gel Agarose 1,5% (Trần Nhân Dũng, 2011)
- Chuẩn bị gel agarose 1,5% (giếng lớn) cần: 40ml TE 1X, 0,6g agarose, 0,8µl SafeView. Hòa tan agarose vào TE 1X trong chai nắp xanh, đậy kín nắp, sau đó nấu gel bằng microwave khoảng 4-5 phút, lấy ra để nguội khoảng 50°C (cầm vừa ấm tay), cho SafeView vào lắc nhẹ.
- Trong thời gian đợi gel nguội, lắp lược vào khuôn gel. Khi gel đã sẵn sàng, rót nhẹ vào góc dưới của khuôn, rót dứt khoát tránh bọt khí. Thông thường, gel được rót dày từ 0,5-1,0cm. Sau khoảng 45 phút gel đặc có màu trắng là sử dụng được.
- Load mẫu: Cắt một mẩu giấy paraffin, chia đều loading buffer lên trên (2µl/giọt). Lần lượt rút 0,8µl sản phẩm PCR, trộn nhẹ với giọt loading buffer bằng pipet (tránh làm gãy DNA) và load vào trong giếng. Thang chuẩn không cần load cùng với loading buffer. Lưu ý: trong quá trình load mẫu, sản phẩm PCR và loading buffer được đặt trên hộp đá.
- Sau khi load xong, đặt gel ngập dung dịch điện di. Điện di với hiệu điện thế thích hợp, 50V cho sản phẩm. Quá trình điện di được quan sát bởi sự di chuyển màu của loading buffer.
- Tắt nguồn điện khi vạch màu xanh của loading buffer đã di chuyển một khoảng cách thích hợp cho sự phân tách các đoạn DNA (thường là 2/3 gel).
- Dùng kẹp kẹp một đầu khay đựng gel, hơi nghiêng để loại bỏ hết dung dịch đệm (cẩn thận gel có thể trượt ra ngoài). Thấm nhẹ bề mặt dưới của khay và đem gel đi chụp hình.
3.2.10. Giải trình tự
- Sản phẩm PCR được gởi giải trình tự ở công ty Macrogen, Hàn Quốc .
- Kết quả giải trình tự các dòng vi khuẩn được so sánh độ tương đồng với các trình tự trên ngân hàng dữ liệu NCBI (National Center for Biotechnology Information) bằng chương trình BLASTN (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Kết hợp các kết quả nhuộm Gram, khả năng di động, v.v. để kết luận tên của các dòng vi khuẩn.
3.2.11. Xử lý số liệu thí nghiệm
Các số liệu thí nghiệm được xử lý thống kê bằng phần mềm Minitab 16 và Microsoft Excel 2010.
CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả phân lập và đặc điểm hình thái
4.1.1. Kết quả phân lập
Từ mẫu nước thải của lò bún Lệ Châu, 24 dòng vi khuẩn đã được phân lập trên môi trường chuyên biệt với nguồn carbon duy nhất là tinh bột (1%). Các dòng vi khuẩn này được ký hiệu theo thứ tự từ D1 đến D24.
Kết quả trải mẫu cho thấy mật số khuẩn lạc giảm dần từ đĩa trải mẫu với độ pha
loãng 10-2 đến 10-5. Các dòng vi khuẩn được phân lập từ các khuẩn lạc của 2 đĩa trải
mẫu với độ pha loãng 10-4 và 10-5 vì ở 2 đĩa này các khuẩn lạc mọc rời rạc với nhau.
Tất cả các dòng vi khuẩn đều ròng sau 3 đến 8 lần cấy chuyển.
4.1.2. Đặc điểm hình thái
a) Đặc điểm khuẩn lạc của 24 dòng vi khuẩn
Trên cùng một môi trường nuôi cấy các vi khuẩn khác nhau phát triển thành các khuẩn lạc khác nhau về một hoặc một số đặc điểm (Bảng 5).
Bảng 5: Đặc điểm khuẩn lạc của 24 dòng vi khuẩn đã phân lập đƣợc
STT Vi
khuẩn
Đặc điểm khuẩn lạc
Hình dạng Dạng bìa Độ nổi Màu sắc Đƣờng kính (mm)
1 D1 Tròn Nguyên Mô Trắng sữa 2 2 D2 Tròn Nguyên Lài Trắng sữa 2 3 D3 Tròn Nguyên Mô Trắng trong 1 4 D4 Tròn Nguyên Mô Trắng sữa 0,5 5 D5 Tròn Nguyên Mô Trắng sữa 2 6 D6 Tròn Nguyên Mô Trắng trong 1,5 7 D7 Không đều Răng cưa Lài Vàng nhạt 2 8 D8 Tròn Nguyên Lài Trắng trong 2 9 D9 Tròn Nguyên Phẳng Vàng nhạt 1 10 D10 Tròn Nguyên Lài Trắng trong 1,5 11 D11 Tròn Nguyên Lài Trắng trong 2 12 D12 Tròn Nguyên Mô Trắng sữa 2,5 13 D13 Tròn Nguyên Mô Trắng trong 2,5 14 D14 Tròn Nguyên Phẳng Trắng sữa 1,5 15 D15 Không đều Chia thùy Phẳng Trắng trong 2,5 16 D16 Không đều Răng cưa Lài Vàng nhạt 2,5 17 D17 Không đều Răng cưa Lài Vàng nhạt 2 18 D18 Tròn Nguyên Lài Trắng trong 2 19 D19 Tròn Nguyên Lài Vàng nhạt 1,5 20 D20 Không đều Chia thùy Phẳng Trắng trong 2,5 21 D21 Tròn Nguyên Lài Trắng trong 2 22 D22 Tròn Răng cưa Lài Trắng sữa 2 23 D23 Tròn Răng cưa Lài Trắng sữa 1,5 24 D24 Tròn Nguyên Phẳng Trắng sữa 1
Sự đa dạng về đặc điểm của khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn được tóm tắt như sau:
Hình dạng khuẩn lạc:
+ 19 dòng vi khuẩn có khuẩn lạc dạng tròn (79,17%). + 5 dòng vi khuẩn có khuẩn lạc dạng không đều (20,83%).
Màu sắc khuẩn lạc:
10 dòng vi khuẩn có khuẩn lạc màu trắng sữa (41,67%). 9 dòng vi khuẩn có khuẩn lạc màu trắng trong (37, 50%). 5 dòng vi khuẩn có khuẩn lạc màu vàng nhạt (20,83%).
Dạng bìa khuẩn lạc:
17 dòng vi khuẩn có khuẩn lạc dạng bìa nguyên (70,83%). 5 dòng vi khuẩn có dạng bìa răng cưa (20,83%).
2 dòng vi khuẩn có dạng bìa chia thùy (8,34%).
Độ nổi:
12 dòng vi khuẩn có độ nổi lài là (50%). 7 dòng vi khuẩn có độ nổi mô (29,17%). 5 dòng vi khuẩn có độ nổi phẳng (20,83%).
Kích thước khuẩn lạc của vi khuẩn trên môi trường tinh bột 1% ủ ở 30o
C trong 48 giờ dao động từ 0,5-2,5mm.
b) Đặc điểm tế bào vi khuẩn
Đặc điểm tế bào của 24 dòng vi khuẩn được mô tả chi tiết về hình dạng, kích thước, Gram và khả năng di động (Bảng 6). Theo đó, tế bào của 24 dòng vi khuẩn có 2 dạng: que dài (chiếm 12,5%) và que ngắn (chiếm 82,5%).
Bảng 6: Đặc điểm tế bào vi khuẩn của 24 dòng vi khuẩn đã phân lập đƣợc
STT Vi khuẩn Hình dạng Kích thƣớc (µm) Gram1 Di động2 1 D1 Que ngắn 0,51×0,86 - + 2 D2 Que dài 0,68×3,42 - + 3 D3 Que ngắn 0,85×1,20 + - 4 D4 Que ngắn 0,51×0,86 - + 5 D5 Que ngắn 0,86×1,02 - + 6 D6 Que ngắn 1,20×1,40 - - 7 D7 Que ngắn 0,51×0,86 - + 8 D8 Que ngắn 0,86×1,71 - + 9 D9 Que ngắn 1,20×1,71 - + 10 D10 Que ngắn 1,90×2,05 + + 11 D11 Que ngắn 0,85×1,20 - - 12 D12 Que ngắn 1,37×1,71 - - 13 D13 Que ngắn 1,20×1,71 - - 14 D14 Que ngắn 1,37×2,05 - + 15 D15 Que dài 0,85×3,42 + + 16 D16 Que dài 1,14×3,42 + + 17 D17 Que ngắn 0,68×2,57 - + 18 D18 Que ngắn 0,68×2,57 - + 19 D19 Que ngắn 0,51×0,86 - + 20 D20 Que ngắn 0,34×1,57 + + 21 D21 Que ngắn 0,51×0,86 - + 22 D22 Que ngắn 1,90×2,22 - + 23 D23 Que ngắn 1,20×1,40 - + 24 D24 Que ngắn 0,85×1,20 - +
1: (+) Gram dương, (-): Gram âm 2: (+): Di động, (-): Không di động
Khả năng di động của vi khuẩn được ghi nhận qua sự mọc lan của vi khuẩn trong môi trong môi trường bán lỏng. Vi khuẩn có thể mọc lan trên bề mặt môi trường hoặc phía dưới bề mặt môi trường (Hình 15). Trong 24 dòng vi khuẩn được phân lập, chỉ có 5 dòng vi khuẩn là không có khả năng chuyển động.
Hình 15: Khả năng chuyển động của vi khuẩn trong môi trƣờng bán lỏng
ĐC: Môi trường bán đặc không có vi khuẩn
(-): Không di động (vi khuẩn chỉ sinh trưởng tại vết cấy)
Trong 24 dòng vi khuẩn được phân lập, số vi khuẩn Gram (+) chiếm 20,83% và vi khuẩn Gram (-) chiếm 79,17%.
Hình 16: Hình nhuộm Gram vi khuẩn với độ phóng đại 1000 lần
a) Dòng D1: Que ngắn Gram (-) b) Dòng D16: Que dài Gram (+) c) Dòng D4: Que ngắn Gram (-) d) Dòng D15: Que dài Gram (+)
4.2. Đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn
Khi kiểm tra hoạt tính catalase, 24 dòng vi khuẩn đều cho kết quả dương tính (Bảng 7). Kết quả này chỉ ra rằng 24 dòng vi khuẩn đều có khả năng tiết ra catalase để
phân hủy H2O2 và có khả năng sống trong điều kiện hiếu khí. Điều này hoàn toàn phù
hợp với điều kiện phân lập và nuôi cấy vi khuẩn (điều kiện hiếu khí). Nếu xử lý nước thải bằng phương pháp vi sinh hiếu khí thì 24 dòng vi khuẩn này đã thỏa mãn điều kiện đầu tiên là có thể sống trong điều kiện có mặt khí oxy.
Bảng 7: Kết quả kiểm tra các đặc tính sinh hóa STT Vi khuẩn Kiểm tra
catalase1 Kiểm tra Methyl red2 1 D1 + - 2 D2 +++ - 3 D3 + - 4 D4 ++ - 5 D5 + - 6 D6 ++ - 7 D7 ++ - 8 D8 ++ - 9 D9 ++ - 10 D10 + - 11 D11 + - 12 D12 + - 13 D13 ++ - 14 D14 ++ - 15 D15 +++ + 16 D16 ++ - 17 D17 + - 18 D18 + - 19 D19 + - 20 D20 +++ - 21 D21 + + 22 D22 + - 23 D23 + - 24 D24 ++ -
1: (+): sủi bọt ít; (++): sủi bọt nhiều; (+++): sủi bọt rất nhiều. 2: (+): màu đỏ; (-): màu vàng.
Sự sủi bọt được quyết định bởi nồng độ H2O2 và hoạt tính catalase của vi khuẩn.
Vì lượng H2O2 được sử dụng khi nhỏ lên các khuẩn lạc vi khuẩn là như nhau (3 giọt)
nên độ sủi bọt trong trường hợp này được quyết định bởi hoạt tính catalase của vi
khuẩn. Vi khuẩn có hoạt tính catalase càng cao thì phản ứng (sủi bọt) với H2O2 càng
mạnh (Hình 17, 18 và 19).
Hình 157: Hoạt tính catalase của dòng D10 (+)