Việc xử lý nước thải bằng phương pháp vi sinh đã và đang được các nhà khoa học trong và ngoài nước quan tâm nghiên cứu. Hầu hết những nghiên cứu đều có điểm chung trong việc phân lập là tìm kiếm những dòng vi sinh vật có khả năng phân hủy các chất hữu cơ từ chính nguồn nước thải chứa nhiều chất hữu cơ đó. Những nghiên cứu đó cũng cho kết quả rất khả quan vì đa phần đã tìm được những vi sinh vật mong muốn.
2.7.1. Trong nƣớc
Năm 2012, Nguyễn Hữu Hiệp và Nguyễn Thị Hải Lý đã thực hiện thành công trong nghiên cứu phân lập các dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy tinh bột tại làng nghề sản xuất bột gạo tại thị xã Sa Đéc, tỉnh Đồng Tháp. Nghiên cứu cho kết quả 4
dòng vi khuẩn phân hủy tinh bột mạnh trong đó dòng 935 và VD2 có khả năng xử lý
đến 97% lượng tinh bột có trong nước thải chỉ sau 24 giờ.
Năm 2010, Vũ Thị Hương Lan phân được 6 dòng vi khuẩn phân hủy tinh bột mạnh từ nước thải sản xuất nui. Các dòng này đều xử lý tốt nước thải từ nhà máy sản xuất nuôi. Sau khi xử lý, giá trị COD của nước thải sản suất nuôi giảm từ 76-88% so với giá trị ban đầu.
Năm 2013, Phạm Thị Ngọc Lan et al. đã phân lập và tuyển chọn được 2 dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy tinh bột mạnh từ bùn ao nuôi tôm ở đầm Sam-Chuồn, Thừa Thiên Huế. Hai dòng này có thể phân hủy tốt protein, lipid và cellulose. Điều đó cho thấy tiềm năng xử lý nước ô nhiễm ở những ao nuôi tôm, nơi có nhiều chất thải hữu cơ như tinh bột, cellulose, protein và lipid.
2.7.2. Ngoài nƣớc
Planococcus donghaensis, một dòng vi khuẩn phân hủy tinh bột được phân lập từ vùng biển phía đông Hàn Quốc bởi Jeong-Hwa et al. (2007).
Myungjin et al. (2010) đã phân lập được dòng vi khuẩn Dyadobacter soli có khả năng phân hủy tinh bột mạnh từ đất ruộng.
Arvinder et al. (2012) đã phân lập được 6 dòng vi khuẩn phân hủy tinh bột mạnh
từ cánh đồng trồng khoai tây.
SulaimanvA. Alrumman et al. (2014) đã phân lập được dòng vi khuẩn Bacillus
axarquiensis trong nước thải của nhà máy chế biến khoai tây Saudi Snack Foods Company. Vi khuẩn này được ứng dụng để xử lý nước thải của nhà máy đó.
2.8. Các phƣơng pháp vi sinh
2.8.1. Phƣơng pháp hộp trải (Nguyễn Văn Minh, 2008)
Phương pháp này dùng que trải trải đều mẫu lên môi trường đĩa để tách riêng biệt các tế bào vi khuẩn. Các tế bào vi khuẩn này sẽ phát triển thành những khuẩn lạc riêng biệt (nhìn rõ bằng mắt thường). Vì khuẩn lạc là một tập đoàn vi sinh vật sinh ra từ một tế bào hay bào tử của vi sinh vật (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2002) nên những khuẩn lạc riêng biệt có đặc điểm khác nhau (trên cùng môi trường) sẽ là những dòng vi khuẩn khác nhau.
2.8.2. Phƣơng pháp đếm sống nhỏ giọt (Hoben và Somasegaran, 1982)
Phương pháp này dùng để đếm số lượng tế bào vi khuẩn sống trong một thể tích nhất định dung dịch chứa vi khuẩn . Khi nhỏ một thể tích nhất định dung dịch chứa vi khuẩn lên môi trường đặc, các tế bào vi khuẩn sống sẽ phát triển thành các khuẩn lạc riêng biệt. Dựa vào số khuẩn lạc, chúng ta sẽ tính được số lượng tế bào vi khuẩn sống trong dung dịch ban đầu.
2.8.3. Phƣơng pháp giếng thạch (Umesh et al., 1989)
Phương pháp này dùng để chọn ra những dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy tinh bột dựa vào đường kính vòng halo không bắt màu với dung dịch Lugol xung
quanh khuẩn lạc trên môi trường kiểm tra hoạt tính amylase.
Tinh bột hòa tan trong môi trường đặc tạo phức với dung dịch Lugol tạo màu tím xanh. Những vi khuẩn phân hủy tinh bột sẽ tiết ra hệ enzyme amylase phân hủy tinh bột xung quanh khuẩn lạc. Tinh bột khi đã bị phân hủy bởi hệ enzyme amylase thì không thể tạo phức màu tím xanh với dung dịch Lugol nữa. Đây là cơ sở để xác định những vi khuẩn phân hủy tinh bột.
Phương pháp giếng thạch dùng đầu côn thủy tinh đục các lỗ giếng và nhỏ vi khuẩn vào đó. Sau thời gian phát triển đầy đủ, vi khuẩn phân hủy tinh bột sẽ tạo một vòng sáng halo. Đường kính của vòng sáng càng lớn thì vi khuẩn phân hủy tinh bột càng mạnh.
2.8.4. Phƣơng pháp thử nghiệm catalase (Nguyễn Lân Dũng, 2006)
Phương pháp này dùng để xác định vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí không bắt buộc
dựa vào khả năng sinh enzyme catalase của vi khuẩn. Sự thủy phân H2O2 bởi catalase
sẽ giải phóng O2 được ghi nhận qua hiện tượng sủi bọt khí khi nhỏ H2O2 vào khuẩn
lạc.
2.8.5. Phƣơng pháp thử Methyl red (Nguyễn Lân Dũng, 2006)
Trong môi trường glucose-phosphate, vi khuẩn sẽ chuyển hóa glucose thành các acid như acid lactic, acid acetic và acid formic. Chính những axit này làm giảm pH của môi trường.
Hình 11: Sự chuyển hóa glucose bởi vi khuẩn
(http://xetnghiemdakhoa.com/diendan/showthread.php?tid=3563)
Vì Methyl red có màu đỏ ở pH < 4.4 nên có thể dùng để nhận diện được sự sinh acid của vi khuẩn trong môi trường glucose-phosphate.
2.9. Kỹ thuật PCR và phƣơng pháp giải trình tự 2.9.1. Kỹ thuật PCR 2.9.1. Kỹ thuật PCR
PCR (Polymerase Chain Reaction) là kỹ thuật sinh học phân tử cho phép nhân bản một đoạn DNA mong muốn từ hệ gen DNA của cơ thể sinh vật thành nhiều bản sao. Kỹ thuật này được phát minh bởi Kary Mullis năm1958 tại công ty Cetus.
* Nguyên lý của kỹ thuật PCR
Kỹ thuật PCR tuân thủ những nguyên tác cơ bản của sao chép DNA trong cơ thể sinh vật:
- Dùng nhiệt độ cao tháo xoắn thay cho enzyme helicase.
- Kết hợp với enzyme DNA polymerase chịu nhiệt để tổng hợp DNA mới trong môi trường thích hợp.
- Hệ thống điều nhiệt thích hợp cùng với các đoạn mồi được thiết kế chuyên biệt chủ động.
Phương pháp PCR cho phép tổng hợp rất nhanh và chính xác từng đoạn DNA riêng biệt. Đây thực sự là phương pháp hiện đại và thuận tiện cho việc xác định sự có mặt của một gen nào đó trong tế bào với độ chính xác cao.
Một phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn: giai đoạn biến tính, giai đoạn bắt cặp, giai đoạn kéo dài:
- Giai đoạn biến tính (denaturation): tách chuỗi DNA từ sợi đôi thành 2 sợi đơn.
Nhiệt độ tăng lên 94-96oC để tách hai sợi DNA ra. Bước này gọi là biến tính vì nhiệt
độ tăng lên sẽ phá vỡ các liên kết hydro giữa hai mạch của phân tử DNA. Trước chu kỳ 1, DNA thường được biến tính đến thời gian mở chuỗi để đảm bảo mẫu DNA và mồi được phân tách hoàn toàn và chỉ còn dạng sợi đơn. Thời gian ở giai đoạn này khoảng 1-2 phút.
- Giai đoạn bắt cặp (annealing): gắn cặp mồi đặc trưng theo nguyên tắc bổ sung. Sau khi 2 sợi DNA tách ra, nhiệt độ được hạ xuống để mồi có thể gắn vào sợ DNA đơn. Nhiệt độ giai đoạn này phụ thuộc vào đoạn mồi và thường thấp hơn nhiệt độ biến
tính khoảng 45-60oC. Sử dụng sai nhiệt độ trong giai đoạn này dẫn đến việc đoạn mồi
không gắn hoàn toàn vào DNA mẫu, hay gắn một cách tùy tiện. Thời gian bắt cặp từ 1-2 phút.
- Giai đoạn kéo dài (extension): tổng hợp chuỗi DNA mới giống chuỗi DNA gốc. DNA polymerase gắn tiếp vào sợi trống. Nó bắt đầu bắm vào và hoạt động dọc theo sợi DNA. Nhiệt độ kéo dài phụ thuộc DNA polymerasse. Thời gian của bước này phụ thuộc vào cả DNA-polymerase và chiều dài mảnh DNA cần khuếch đại.
Các đoạn DNA mới được hình thành lại được sử dụng làm khuôn để tổng hợp cho các chu kỳ tiếp theo.
Như vậy số lượng bản sao sẽ tăng gấp 2 sau mỗi chu kỳ và sau n chu kỳ, tính
theo lý thuyết số lượng bản sao là 2n.
* Chu kỳ nhiệt:
Ba giai đoạn chính trong phản ứng PCR được lặp đi lặp lại nhiều lần (chu kỳ), thường từ 25 đến 75 chu kỳ cho đến khi kết thúc phản ứng.
2.9.2. Giải trình tự *Giới thiệu *Giới thiệu
Giải trình tự một phân tử DNA tức là phát hiện thứ tự sắp xếp của 4 loại nucleotides A (Adenine), C (Cytosine), G (guanine) và T (thymine) trên phân tử DNA đó.
* Phƣơng pháp hóa học của Maxam và Gilbert (1997)
Giải trình tự bằng phương pháp hóa học được Maxam và Gilbert tìm ra năm 1997. Phương pháp gồm có 4 bước:
- Đánh dấu một đầu của đoạn DNA cần phải giải trình tự bằng một gốc phospho
đồng vị phóng xạ (32
P).
- Xử lý các đoạn DNA đã đánh dấu này với chất hóa học có thể làm biến đổi đặc hiệu một hoặc hai base của nucleotide trên đoạn DNA. Các chất hóa học được dùng là dimethylsulphate (biến đổi G), hydrazine (biến đổi T và C), hỗn hợp hydrazine và NaCl (làm biến đổi C), acid (làm biến đổi G và A) và NaOH (biến đổi A và C). Như vậy, trong giai đoạn này phải dùng ít nhất 4 ống nghiệm và trong mỗi ống nghiệm, DNA được xử lý với một lượng rất giới hạn của một trong các chất hóa học nêu trên để mỗi ống nghiệm chỉ có chứa các đoạn DNA mà trên mỗi đoạn DNA này chỉ có một vị trí nucleotide đặc hiệu với chất hóa học là bị biến đổi.
- Các nucleotide bị biến đổi sẽ được lấy ra khỏi mạch khung đường phosphate
của đoạn DNA, nhờ đó tách ra được mạch đơn có một đầu đánh dấu 32P và một đầu bị
mất phân tử base vì phân tử này bị lấy ra khỏi mạch khung.
- Điện di mẫu DNA đã xử lý trong 4 ống nghệm trên 4 hàng của một gel polyacrylamide biến tính để các mạch đơn di chuyển trong gel không bị biến đổi trong quá trình diện di. Sau khi điện di, các mạch đơn sẽ bị dừng tại các vị trí khác nhau, tùy thuộc mạch đơn này dài ngắn khác nhau, theo suốt chiều dài của gel. Áp gel đã chạy điện di này lên một gel nhạy tia X, các vị trí dừng lại của các mạch đơn trên gel điện di
sẽ tạo thành các vạch trên film vì các vị trí này đều bị đánh dấu phóng xạ 32P. Từ các
vạch trên film, ta có thể đọc được trình tự của các nucleotide trong đoạn DNA.
Phương pháp hóa học rất khó thực hiện vì cần phải xác định khá nhiều thông số tối ưu cho thí nghiệm, nhất là phải xác định nồng độ giới hạn của các chất hóa học sao cho khi xử lí mẫu DNA thì trên mỗi đoạn DNA chỉ có một base bị biến đổi để ứng với
mỗi vị trí của base bị biến đổi thì sẽ có một mạch đơn có đánh dấu 32P được tách ra.
Chính vì sự phức tạp này mà phương pháp hóa học hiện nay ít được sử dụng.
* Phƣơng pháp phản ứng chuỗi của Sanger (1997)
Phương pháp gồm có 3 bước:
- Chèn các đoạn DNA cần phải giải trình tự vào một vector là phage hay plasmid tại một vị trí mà trình tự chuỗi của vị trí này đã được định rõ. Đưa các vector mang đoạn chèn này vào tế bào vi khuẩn để nhân bản. Sau đó tách chiết và tinh khiết các vector từ vi khuẩn để thành các vector tự do.
- Dùng các đoạn mồi bổ sung một cách đặc hiệu với trình tự của vector tại vị trí chèn đoạn. Thêm vào ống phản ứng DNA polymerase và 4 loại nucleotide tự do (dNTP) và một lượng rất giới hạn ddNTP. Phản ứng được thực hiện trong 4 ống và mỗi ống cho một loại ddNTP khác nhau. DNA polymerase sẽ kéo các dNTP vào để tổng hợp mạch đơn bổ sung với mạch DNA chèn trên vector và sự tổng hợp mạch đơn sẽ bị dừng lại tại vị trí mà ddNTP được kéo vào thay vì dNTP. Lý do sự tổng hợp bị dừng lại là vì ddNTP có cấu trúc hóa học bị mất đi gốc OH tại vị trí carbon thứ 3 của đường deoxyribose mà gốc OH ở vị trí này là nơi dNTP kế tiếp gắn vào . Nhờ vậy trong ống phản ứng có các mạch đơn DNA có chiều dài khác nhau tương ứng với các vị trí trình tự các nucleotide trên đoạn DNA gốc.
- Để giải trình từ người ta diện di DNA tổng hợp trên gel polyacrylamide biến
tính. Với phương pháp đánh dấu mồi hay các dNTP bằng các đồng vị phóng xạ 32P hay
35S thì sau khi điện di, cũng giống như phương pháp hóa học , người ta phát hiện các
vạch điện di bằng kỹ thuật xạ ký tự ghi và từ các vạch này giải được trình tự của đoạn DNA.
Phương pháp phản ứng chuỗi của Sanger có ưu điểm là nhanh chóng và đơn giản hơn nhiều so với phương pháp hóa học nên hiện nay phương pháp này được sử dụng rộng rãi.
* Giải trình tự bằng máy tự động (automatic sequencer)
Cấu tạo của một máy giải trình tự tự động gồm hai phần chính yếu: phần điện di với gel polyacrylamide và phần phát hiện các vạch điện di. Phần diện di có thể là một gel hay một ống mao quản chứa gel. Phần phát hiện vạch điện di là những con mắt cảm quan và một chùm tia laser đi qua trước nó. Nguyên tắc hoạt động của máy này là trong suốt quá trình điện di, mỗi khi có một vạch điện di đi qua chùm tia laser thì vạch điện di sẽ phát sáng lên và sự phát sáng này sẽ được con mắt cảm quang ghi nhận và lưu lại thành một đỉnh cường độ sáng trong biểu đồ. Từ các đỉnh của các cường độ sáng này máy sẽ so dòng của các đỉnh tương ứng với các màu để cuối cùng phân tích thành trình tự của đoạn DNA. Ngày nay, người ta có thể dùng 4 loại huỳnh quang khác nhau để đánh dấu 4 loại ddNTP, nhờ vậy phản ứng giải trình tự có thể thực hiện được chỉ trong một ống nghiệm và khi giải trình tự chỉ cần điện di trên một hàng mà không cần phải trên 4 hàng như trước đây.
CHƢƠNG 3. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Phƣơng tiện nghiên cứu
3.1.1. Địa điểm nghiên cứu và tiến độ thực hiện
Địa điểm thu mẫu: Địa điểm lấy mẫu là lò bún Lệ Châu (140, Đường Điện Biên
Phủ, Phường 6, TP. Sóc Trăng, Tỉnh Sóc Trăng).
Địa điểm nghiên cứu: phòng thí nghiệm Vi sinh vật, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ sinh học của trường Đại học Cần Thơ.
Luận văn được tiến hành trong 4 tháng (8/2014-11/2014).
3.1.2. Vật liệu
Mẫu nước thải từ quá trình sản xuất bún của lò bún Lệ Châu (140, Đường Điện
Biên Phủ, Phường 6, TP. Sóc Trăng, Tỉnh Sóc Trăng).
Yêu cầu khoa học: nước thải chứa nhiều tinh bột và lò bún này chưa từng sử dụng bất cứ chế phẩm vi sinh nào để xử lý nước thải.
Chọn lấy mẫu nước thải đang trong giai đoạn phân hủy. Lấy nước thải từ độ sâu 30-0cm.
Thu 500ml nước thải, trữ trong chai thủy tinh có nắp vặn vô trùng. Đặt chai chứa mẫu trong thùng xốp, cho nước đá vào để bảo quản mang về phòng thí nghiệm.
3.1.3. Dụng cụ và thiết bị 3.1.3.1. Dụng cụ 3.1.3.1. Dụng cụ
- Đĩa petri thủy tinh.
- Ống nghiệm chịu nhiệt có nắp vặn dung tích 10ml. - Que cấy thép, que trải thủy tinh.
- Đèn cồn.
- Ống đong nhựa 1000ml, ống đong thủy tinh 200ml.
- Micropipette 1000-5000µl, micropipette 100-1000µl, micropipette 20-200µl, micropipette 2-20µl.
- Các loại đầu côn nhựa chịu nhiệt, đầu côn thủy tinh chịu nhiệt. - Tube eppendorf .
- Chai thủy tinh chịu nhiệt có nắp vặn loại 1000ml, 500ml, 250ml và 100ml. - Lam và lamen.
- Cốc thủy tinh.
- Những dụng cụ thông dụng khác như túi nylon, rổ đựng, khay đựng, v.v..
3.1.3.2. Thiết bị
- Tủ cấy vô trùng.
- Nồi khử trùng nhiệt ướt. - Tủ ủ vi sinh vật. - Máy vortex. - Cân điện tử. -Máy đo pH. - Kính hiển vi quang học. - Máy lắc mẫu.
- Máy khuấy từ gia nhiệt. - Máy chụp hình kỹ thuật số.
3.1.4. Hóa chất và môi trƣờng 3.1.4.1. Hóa chất
*Hóa chất dùng trong thí nghiệm nhận diện vi khuẩn phân hủy tinh bột - Pepton, cao nấm men, agar, tinh bột.
- Thuốc thử lugol: I2 0.5g, KI 1g và nước cất vừa đủ 100ml.
* Hóa chất kiểm tra đặc tính sinh hóa - Dung dịch H2O2 3%.
- Thuốc thử Methyl red: Methyl red 0,1g, ethanol 95% 300ml vào nước cất vừa