* Mục đích
Khuếch đại vùng gene 16S rRNA của vi khuẩn đến một lượng cần thiết vừa đủ để diện di trên gel agarose và giải trình tự.
* Cách tiến hành
Quy trình ly trích DNA từ khuẩn lạc ròng
- Chọn 10 khuẩn lạc ròng cho vào tube eppendof 2,2ml. - Cho 1 viên bi sắt vào tube và lắc bằng máy lắc.
- Cho vào 1ml Lysis buffer, lắc đều, ủ ở nhiệt độ phòng trong 10phút. - Ly tâm 13000rpm/5phút, lấy phần dung dịch chuyển sang tube mới.
- Cho một lượng tương đương ethanol 95%, đảo nhẹ các ống tube, ủ 10phút ở nhiệt độ phòng sau đó ly tâm 13000 rpm/5phút, bỏ phần dung dịch phía trên.
- Rửa phần tủa bằng 500 µl ethanol 70%, ly tâm 13000 rpm/5phút. - Sấy khô chân không trong 10 phút.
- Hòa tan trong 100 µl TE 0,1X. - Trữ ở -20 oC.
Phản ứng khuếch đại DNA
- Khuếch đại DNA bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi27F-1492R (Lane, 1991): 27F- 5’-AGAGTTTAGTCCTTGGCTCAG- 3’
- Sau khi ly trích nhanh DNA của những dòng vi khuẩn được tuyển chọn, tiến hành PCR bằng máy PCR Perkin Elmer PE 9700 (Hoa Kỳ) với hai đoạn mồi nêu trên.
Bảng 3: Thành phần các chất trong một phản ứng PCR Thành phần 1 phản ứng (µl) Nước cất 2 lần 12,5 Buffer 10X 2,5 MgCl2 25mM 2 dNTP 4 Mồi xuôi 8F 1 Mồi ngược 1492R 1 Taq DNA po ymerase 0,25 DNA vi khuẩn 2 Tổng thể tích 25
- Phản ứng PCR gồm có các giai đoạn như sau:
Bảng 4: Các giai đoạn của phản ứng PCR Giai đoạn Tên giai đoạn Chu kỳ Nhiệt độ (oC) Thời gian
1 Biến tính 95oC 5 phút
2 Biến tính 95oC 30 giây
Bắt cặp 38 55oC 30 giây
Kéo dài 72oC 5 phút
3 Kéo dài 72oC 10 phút
- Sản phẩm PCR sẽ được dùng để diện di trên gel agarose 1,5% và gửi giải trình tự ở Hàn Quốc.
* Điện di sản phẩm PCR trên gel Agarose 1,5% (Trần Nhân Dũng, 2011)
- Chuẩn bị gel agarose 1,5% (giếng lớn) cần: 40ml TE 1X, 0,6g agarose, 0,8µl SafeView. Hòa tan agarose vào TE 1X trong chai nắp xanh, đậy kín nắp, sau đó nấu gel bằng microwave khoảng 4-5 phút, lấy ra để nguội khoảng 50°C (cầm vừa ấm tay), cho SafeView vào lắc nhẹ.
- Trong thời gian đợi gel nguội, lắp lược vào khuôn gel. Khi gel đã sẵn sàng, rót nhẹ vào góc dưới của khuôn, rót dứt khoát tránh bọt khí. Thông thường, gel được rót dày từ 0,5-1,0cm. Sau khoảng 45 phút gel đặc có màu trắng là sử dụng được.
- Load mẫu: Cắt một mẩu giấy paraffin, chia đều loading buffer lên trên (2µl/giọt). Lần lượt rút 0,8µl sản phẩm PCR, trộn nhẹ với giọt loading buffer bằng pipet (tránh làm gãy DNA) và load vào trong giếng. Thang chuẩn không cần load cùng với loading buffer. Lưu ý: trong quá trình load mẫu, sản phẩm PCR và loading buffer được đặt trên hộp đá.
- Sau khi load xong, đặt gel ngập dung dịch điện di. Điện di với hiệu điện thế thích hợp, 50V cho sản phẩm. Quá trình điện di được quan sát bởi sự di chuyển màu của loading buffer.
- Tắt nguồn điện khi vạch màu xanh của loading buffer đã di chuyển một khoảng cách thích hợp cho sự phân tách các đoạn DNA (thường là 2/3 gel).
- Dùng kẹp kẹp một đầu khay đựng gel, hơi nghiêng để loại bỏ hết dung dịch đệm (cẩn thận gel có thể trượt ra ngoài). Thấm nhẹ bề mặt dưới của khay và đem gel đi chụp hình.
3.2.10. Giải trình tự
- Sản phẩm PCR được gởi giải trình tự ở công ty Macrogen, Hàn Quốc .
- Kết quả giải trình tự các dòng vi khuẩn được so sánh độ tương đồng với các trình tự trên ngân hàng dữ liệu NCBI (National Center for Biotechnology Information) bằng chương trình BLASTN (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Kết hợp các kết quả nhuộm Gram, khả năng di động, v.v. để kết luận tên của các dòng vi khuẩn.
3.2.11. Xử lý số liệu thí nghiệm
Các số liệu thí nghiệm được xử lý thống kê bằng phần mềm Minitab 16 và Microsoft Excel 2010.
CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả phân lập và đặc điểm hình thái
4.1.1. Kết quả phân lập
Từ mẫu nước thải của lò bún Lệ Châu, 24 dòng vi khuẩn đã được phân lập trên môi trường chuyên biệt với nguồn carbon duy nhất là tinh bột (1%). Các dòng vi khuẩn này được ký hiệu theo thứ tự từ D1 đến D24.
Kết quả trải mẫu cho thấy mật số khuẩn lạc giảm dần từ đĩa trải mẫu với độ pha
loãng 10-2 đến 10-5. Các dòng vi khuẩn được phân lập từ các khuẩn lạc của 2 đĩa trải
mẫu với độ pha loãng 10-4 và 10-5 vì ở 2 đĩa này các khuẩn lạc mọc rời rạc với nhau.
Tất cả các dòng vi khuẩn đều ròng sau 3 đến 8 lần cấy chuyển.
4.1.2. Đặc điểm hình thái
a) Đặc điểm khuẩn lạc của 24 dòng vi khuẩn
Trên cùng một môi trường nuôi cấy các vi khuẩn khác nhau phát triển thành các khuẩn lạc khác nhau về một hoặc một số đặc điểm (Bảng 5).
Bảng 5: Đặc điểm khuẩn lạc của 24 dòng vi khuẩn đã phân lập đƣợc
STT Vi
khuẩn
Đặc điểm khuẩn lạc
Hình dạng Dạng bìa Độ nổi Màu sắc Đƣờng kính (mm)
1 D1 Tròn Nguyên Mô Trắng sữa 2 2 D2 Tròn Nguyên Lài Trắng sữa 2 3 D3 Tròn Nguyên Mô Trắng trong 1 4 D4 Tròn Nguyên Mô Trắng sữa 0,5 5 D5 Tròn Nguyên Mô Trắng sữa 2 6 D6 Tròn Nguyên Mô Trắng trong 1,5 7 D7 Không đều Răng cưa Lài Vàng nhạt 2 8 D8 Tròn Nguyên Lài Trắng trong 2 9 D9 Tròn Nguyên Phẳng Vàng nhạt 1 10 D10 Tròn Nguyên Lài Trắng trong 1,5 11 D11 Tròn Nguyên Lài Trắng trong 2 12 D12 Tròn Nguyên Mô Trắng sữa 2,5 13 D13 Tròn Nguyên Mô Trắng trong 2,5 14 D14 Tròn Nguyên Phẳng Trắng sữa 1,5 15 D15 Không đều Chia thùy Phẳng Trắng trong 2,5 16 D16 Không đều Răng cưa Lài Vàng nhạt 2,5 17 D17 Không đều Răng cưa Lài Vàng nhạt 2 18 D18 Tròn Nguyên Lài Trắng trong 2 19 D19 Tròn Nguyên Lài Vàng nhạt 1,5 20 D20 Không đều Chia thùy Phẳng Trắng trong 2,5 21 D21 Tròn Nguyên Lài Trắng trong 2 22 D22 Tròn Răng cưa Lài Trắng sữa 2 23 D23 Tròn Răng cưa Lài Trắng sữa 1,5 24 D24 Tròn Nguyên Phẳng Trắng sữa 1
Sự đa dạng về đặc điểm của khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn được tóm tắt như sau:
Hình dạng khuẩn lạc:
+ 19 dòng vi khuẩn có khuẩn lạc dạng tròn (79,17%). + 5 dòng vi khuẩn có khuẩn lạc dạng không đều (20,83%).
Màu sắc khuẩn lạc:
10 dòng vi khuẩn có khuẩn lạc màu trắng sữa (41,67%). 9 dòng vi khuẩn có khuẩn lạc màu trắng trong (37, 50%). 5 dòng vi khuẩn có khuẩn lạc màu vàng nhạt (20,83%).
Dạng bìa khuẩn lạc:
17 dòng vi khuẩn có khuẩn lạc dạng bìa nguyên (70,83%). 5 dòng vi khuẩn có dạng bìa răng cưa (20,83%).
2 dòng vi khuẩn có dạng bìa chia thùy (8,34%).
Độ nổi:
12 dòng vi khuẩn có độ nổi lài là (50%). 7 dòng vi khuẩn có độ nổi mô (29,17%). 5 dòng vi khuẩn có độ nổi phẳng (20,83%).
Kích thước khuẩn lạc của vi khuẩn trên môi trường tinh bột 1% ủ ở 30o
C trong 48 giờ dao động từ 0,5-2,5mm.
b) Đặc điểm tế bào vi khuẩn
Đặc điểm tế bào của 24 dòng vi khuẩn được mô tả chi tiết về hình dạng, kích thước, Gram và khả năng di động (Bảng 6). Theo đó, tế bào của 24 dòng vi khuẩn có 2 dạng: que dài (chiếm 12,5%) và que ngắn (chiếm 82,5%).
Bảng 6: Đặc điểm tế bào vi khuẩn của 24 dòng vi khuẩn đã phân lập đƣợc
STT Vi khuẩn Hình dạng Kích thƣớc (µm) Gram1 Di động2 1 D1 Que ngắn 0,51×0,86 - + 2 D2 Que dài 0,68×3,42 - + 3 D3 Que ngắn 0,85×1,20 + - 4 D4 Que ngắn 0,51×0,86 - + 5 D5 Que ngắn 0,86×1,02 - + 6 D6 Que ngắn 1,20×1,40 - - 7 D7 Que ngắn 0,51×0,86 - + 8 D8 Que ngắn 0,86×1,71 - + 9 D9 Que ngắn 1,20×1,71 - + 10 D10 Que ngắn 1,90×2,05 + + 11 D11 Que ngắn 0,85×1,20 - - 12 D12 Que ngắn 1,37×1,71 - - 13 D13 Que ngắn 1,20×1,71 - - 14 D14 Que ngắn 1,37×2,05 - + 15 D15 Que dài 0,85×3,42 + + 16 D16 Que dài 1,14×3,42 + + 17 D17 Que ngắn 0,68×2,57 - + 18 D18 Que ngắn 0,68×2,57 - + 19 D19 Que ngắn 0,51×0,86 - + 20 D20 Que ngắn 0,34×1,57 + + 21 D21 Que ngắn 0,51×0,86 - + 22 D22 Que ngắn 1,90×2,22 - + 23 D23 Que ngắn 1,20×1,40 - + 24 D24 Que ngắn 0,85×1,20 - +
1: (+) Gram dương, (-): Gram âm 2: (+): Di động, (-): Không di động
Khả năng di động của vi khuẩn được ghi nhận qua sự mọc lan của vi khuẩn trong môi trong môi trường bán lỏng. Vi khuẩn có thể mọc lan trên bề mặt môi trường hoặc phía dưới bề mặt môi trường (Hình 15). Trong 24 dòng vi khuẩn được phân lập, chỉ có 5 dòng vi khuẩn là không có khả năng chuyển động.
Hình 15: Khả năng chuyển động của vi khuẩn trong môi trƣờng bán lỏng
ĐC: Môi trường bán đặc không có vi khuẩn
(-): Không di động (vi khuẩn chỉ sinh trưởng tại vết cấy)
Trong 24 dòng vi khuẩn được phân lập, số vi khuẩn Gram (+) chiếm 20,83% và vi khuẩn Gram (-) chiếm 79,17%.
Hình 16: Hình nhuộm Gram vi khuẩn với độ phóng đại 1000 lần
a) Dòng D1: Que ngắn Gram (-) b) Dòng D16: Que dài Gram (+) c) Dòng D4: Que ngắn Gram (-) d) Dòng D15: Que dài Gram (+)
4.2. Đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn
Khi kiểm tra hoạt tính catalase, 24 dòng vi khuẩn đều cho kết quả dương tính (Bảng 7). Kết quả này chỉ ra rằng 24 dòng vi khuẩn đều có khả năng tiết ra catalase để
phân hủy H2O2 và có khả năng sống trong điều kiện hiếu khí. Điều này hoàn toàn phù
hợp với điều kiện phân lập và nuôi cấy vi khuẩn (điều kiện hiếu khí). Nếu xử lý nước thải bằng phương pháp vi sinh hiếu khí thì 24 dòng vi khuẩn này đã thỏa mãn điều kiện đầu tiên là có thể sống trong điều kiện có mặt khí oxy.
Bảng 7: Kết quả kiểm tra các đặc tính sinh hóa STT Vi khuẩn Kiểm tra
catalase1 Kiểm tra Methyl red2 1 D1 + - 2 D2 +++ - 3 D3 + - 4 D4 ++ - 5 D5 + - 6 D6 ++ - 7 D7 ++ - 8 D8 ++ - 9 D9 ++ - 10 D10 + - 11 D11 + - 12 D12 + - 13 D13 ++ - 14 D14 ++ - 15 D15 +++ + 16 D16 ++ - 17 D17 + - 18 D18 + - 19 D19 + - 20 D20 +++ - 21 D21 + + 22 D22 + - 23 D23 + - 24 D24 ++ -
1: (+): sủi bọt ít; (++): sủi bọt nhiều; (+++): sủi bọt rất nhiều. 2: (+): màu đỏ; (-): màu vàng.
Sự sủi bọt được quyết định bởi nồng độ H2O2 và hoạt tính catalase của vi khuẩn.
Vì lượng H2O2 được sử dụng khi nhỏ lên các khuẩn lạc vi khuẩn là như nhau (3 giọt)
nên độ sủi bọt trong trường hợp này được quyết định bởi hoạt tính catalase của vi
khuẩn. Vi khuẩn có hoạt tính catalase càng cao thì phản ứng (sủi bọt) với H2O2 càng
mạnh (Hình 17, 18 và 19).
Hình 157: Hoạt tính catalase của dòng D10 (+)
a) Trước khi nhỏ H2O2 b) Sau khi nhỏ H2O2
Hình 18: Hoạt tính catalase của dòng D8 (++)
a) Trước khi nhỏ H2O2
b) Sau khi nhỏ H2O2
Hình 19: Hoạt tính catalase của dòng D20 (+++)
Kết quả kiểm tra Methyl red cho thấy chỉ có dòng D15 và D20 là có khả năng sinh acid làm giảm pH của môi trường glucose phosphate sau 3 ngày nuôi cấy. Trong đó dòng D20 sinh acid nhiều hơn dòng D15 vì làm chuyển mau môi trường đậm hơn khi nhỏ dung dịch Methyl red (Hình 20).
4.3. Kết quả kiểm tra hoạt tính amylase
Giếng của đối chứng dương (VD2) luôn xuất hiện vòng sáng halo và giếng của
đối chứng âm (LB) không xuất hiện khuẩn lạc chứng tỏ môi trường kiểm tra hoạt tính amylase đạt yêu cầu và môi trường LB không bị nhiễm vi khuẩn lạ trong quá trình nuôi tăng sinh vi khuẩn (Hình 21 và 22). Vì vậy có thể dựa vào hiệu số giữa đường kính trung bình vòng halo (D) và đường kính trung bình khuẩn lạc (d) của các dòng vi khuẩn để đánh giá khả năng phân hủy tinh bột của chúng.
Hình 21: Kết quả kiểm tra hoạt tính amylase của dòng vi khuẩn D15
a) Trước khi phủ môi trường với dung dịch Lugol b) Sau khi phủ môi trường với dung dịch Lugol
Hình 22: Kết quả kiểm tra hoạt tính amylase của dòng vi khuẩn D15
a) Trước khi phủ lên môi trường với dung dịch Lugol b) Sau khi phủ lên môi trường với dung dịch Lugol
Kết quả kiểm tra hoạt tính amylase cũng đã chỉ ra 8 dòng vi khuẩn xuất hiện vòng halo xung quanh khuẩn lạc (Bảng 8). Những dòng vi khuẩn này có khả năng tiết ra enzyme amylase để thủy phân vùng tinh bột xung quanh khuẩn lạc nên vùng đó không bắt màu xanh tím khi phủ ngập môi trường bằng dung dịch Lugol.
Bảng 8: Những dòng vi khuẩn có hoạt tính amylase
STT Vi khuẩn Đƣờng kính khuẩn lạc trung bình (d) (mm) Đƣờng kính vòng halo trung bình(D) (mm) Hiệu số (D-d)* 1 D2 10,33 20,67 10,34b 2 D7 6,67 12,33 5,63de 3 D8 8,33 15,00 6,67cd 4 D15 10,67 25,00 14,33a 5 D16 11,67 27,67 16,00a 6 D17 9,33 19,33 10,00b 7 D18 10,67 14,33 3,66e 8 D20 10,33 19,33 9,00bc CV(%)=8,27
(*): Các giá trị trung bình theo sau có cùng ký tự biểu thị sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức 5%.
Đường kính khuẩn lạc của 8 dòng vi khuẩn có hoạt tính amylase dao động từ 6,67 đến 11,67 mm trong khi khoảng dao động của đường kính vòng halo là 14,33- 20,67 mm.
Hiệu số D-d của 2 dòng vi khuẩn D15 và D16 cao nhất và khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% so với các dòng còn lại chứng tỏ hai dòng vi khuẩn D15 và D16 có khả năng phân hủy tinh bột mạnh nhất trong 8 dòng được khảo sát. Do đó 2 dòng vi khuẩn này được chọn để làm thí nghiệm khảo sát sự tăng trưởng theo thời gianvà giải trình tự.
4.4. Sự tăng trƣởng của vi khuẩn theo thời gian
Mật số của vi khuẩn khác biệt có ý nghĩa thống kê (5%) ở thời điểm 12 và 24 giờ. Ở thời điểm 12 giờ mật số của dòng D16 cao hơn rõ rệt so mật số của dòng D15 và ngược lại ở thời điểm 24 giờ. Tuy nhiên, mật số của 2 dòng vi khuẩn D15 và D16 có sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở thời điểm 0 và 36 giờ (Hình 23).
Hình 23: Mật số của 2 dòng vi khuẩn D15 và D16 ở các thời điểm
Vì mật số ban đầu của 2 dòng vi khuẩn có sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê nên sự khác biệt giữa mật số của 2 dòng vi khuẩn ở 12 và 24 giờ liên quan chủ yếu đến tốc độ tăng trưởng của chúng. Dựa vào mật số ta tính được tốc độ tăng trưởng của 2 dòng vi khuẩn như sau:
- Giai đoạn 0-12 giờ: kD15=0,65 (lần/giờ), kD16=0,75 (lần/giờ). Dễ thấy kD16>kD15
nên ở giai đoạn này dòng D16 phát triển nhanh hơn dòng D15.
- Giai đoạn 12-24 giờ: kD15=0,19 (lần/giờ), kD16=0,03 (lần/giờ). Dễ thấy kD15>kD1
nên ở giai đoạn này dòng D15 phát triển nhanh hơn dòng D16.
Ở giai đoạn 0-12 giờ vi khuẩn phát triển nhanh, đường tăng trưởng của 2 dòng vi khuẩn đều hướng lên và có độ dốc lớn. Vi khuẩn phát triển nhanh là do ở giai đoạn này môi trường còn rất nhiều dinh dưỡng. Trong giai đoạn này đường tăng trưởng của dòng D16 có độ dốc cao hơn đường tăng trưởng của dòng D15. Ở giai đoạn 12-24 giờ sự phát triển vẫn tiếp tục, nhưng độ dốc của đường tăng trưởng nhỏ hơn so với giai đoạn trước và vi khuẩn bắt đầu vào pha cân bằng do nồng độ chất dinh dưỡng trong môi trường giảm đáng kể. Trong giai đoạn 12-24 giờ, đường tăng trưởng của dòng D15 có độ dốc cao hơn đường tăng trưởng của dòng D16. Bước qua giai đoạn 12-36 giờ, đường tăng trưởng của 2 dòng đều đi xuống cho thấy giai đoạn này vi khuẩn của
Hình 24: Đƣờng tăng trƣởng của 2 dòng vi khuẩn D15 và D16 theo thời gian
Thí nghiệm này chỉ rõ mật số của vi khuẩn ở các thời điểm phụ thuộc vào mật số