3.1.3.1. Dụng cụ
- Đĩa petri thủy tinh.
- Ống nghiệm chịu nhiệt có nắp vặn dung tích 10ml. - Que cấy thép, que trải thủy tinh.
- Đèn cồn.
- Ống đong nhựa 1000ml, ống đong thủy tinh 200ml.
- Micropipette 1000-5000µl, micropipette 100-1000µl, micropipette 20-200µl, micropipette 2-20µl.
- Các loại đầu côn nhựa chịu nhiệt, đầu côn thủy tinh chịu nhiệt. - Tube eppendorf .
- Chai thủy tinh chịu nhiệt có nắp vặn loại 1000ml, 500ml, 250ml và 100ml. - Lam và lamen.
- Cốc thủy tinh.
- Những dụng cụ thông dụng khác như túi nylon, rổ đựng, khay đựng, v.v..
3.1.3.2. Thiết bị
- Tủ cấy vô trùng.
- Nồi khử trùng nhiệt ướt. - Tủ ủ vi sinh vật. - Máy vortex. - Cân điện tử. -Máy đo pH. - Kính hiển vi quang học. - Máy lắc mẫu.
- Máy khuấy từ gia nhiệt. - Máy chụp hình kỹ thuật số.
3.1.4. Hóa chất và môi trƣờng 3.1.4.1. Hóa chất
*Hóa chất dùng trong thí nghiệm nhận diện vi khuẩn phân hủy tinh bột - Pepton, cao nấm men, agar, tinh bột.
- Thuốc thử lugol: I2 0.5g, KI 1g và nước cất vừa đủ 100ml.
* Hóa chất kiểm tra đặc tính sinh hóa - Dung dịch H2O2 3%.
- Thuốc thử Methyl red: Methyl red 0,1g, ethanol 95% 300ml vào nước cất vừa đủ 500ml.
* Hóa chất nhuộm Gram
- Dung dịch Iod: I2 1g, KI 2g, NaHCO3 (5%) 60ml và nước cất 24ml.
- Dung dịch fuchsin: fuchsin 1g, ethanol 95% 100ml, dung dịch phenol 5% 100ml.
- Phẩm nhuộm crystal violet:
+ Dung dịch A: crystal violet (85%) 20g, ethanol 95% 100ml.
+ Pha dung dịch A trong nước với tỷ lệ 1:10 ta có hỗn hợp C. Trộn B với C theo tỷ lệ 4:1 ta được phẩm nhuộm crystal violet.
- Dung dịch rượu tẩy màu crystal violet: ethanol 95% 250ml, aceton 250ml. - Ethanol 70%, Nước cất hai lần vô trùng.
*Hóa chất dùng để chuẩn pH - KOH 1M. - CH3COOH 1M. * Hóa chất khử trùng - Khử trùng tay: ethanol 70%. - Đèn cồn: ethanol 95%. 3.1.4.2. Môi trƣờng
*Môi trƣờng phân lập (Shengwei et al., 2012)
- Thành phần môi trường phân lập: K2HPO2 1,9g/l, KH2PO4 0,94g/l, KCl 1,6g/l,
NaCl 1,43g/l, NH4Cl 0,15g/l, MgSO4.7H2O 0,037g/l, CaCl2.2H2O 0,017g/l, tinh bột 10g/l, Agar 20g/l (3g/l cho môi trường bán lỏng), cyclohexamide 0,1g/l (khi trải mẫu), nước cất vừa đủ 1 lít, chuẩn pH =7-7,2.
- Chức năng: là môi trường chuyên biệt dùng để phân lập vi khuẩn phân hủy tinh bột với nguồn carbon là tinh bột.
- Cách chuẩn bị môi trường:
+ Môi trường đĩa: Cho một ít nước cất vào chai thủy tinh chịu nhiệt có nắp vặn. Hòa tan các khoáng chất và cao nấm men. Bổ sung tinh bột và agar. Cho nước cất đến thể tích cần dùng. Đun trên bếp từ gia nhiệt cho đến khi tinh bột chuyển thành dạng hồ hoàn toàn. Vặn nắp chai (không vặn quá chặt) và đem khử trùng nhiệt ướt ở 121oC, 1atm trong 20 phút, để nguội đến khoảng 80o
C rồi phân phối 15-20ml vào mỗi đĩa petri (loại 80x15 mm) (tiến hành trong tủ cấy vô trùng). Khi hơi nước bay hơi hết thì úp ngược, cho vào túi nylon buột miệng, trữ qua đêm trong tủ ủ ở 30oC để kiểm tra những đĩa bị nhiễm vi sinh vật từ môi trường bên ngoài.
+ Môi trường ống nghiêng: cách chuẩn bị cũng tương tự như môi trường phân lập đĩa nhưng phân phối khoảng 4-5ml vào ống chịu nhiệt có nắp vặn 10ml rồi mới
đem khử trùng. Khử trùng xong thì tiến hành nghiêng ống. Trữ qua đêm trong tủ ủ ở 30oC để kiểm tra những đĩa bị nhiễm vi sinh vật từ môi trường bên ngoài.
* Môi trƣờng kiểm tra hoạt tính amylase (Nguyễn Lân Dũng, 2006)
- Thành phần: Peptone 5g/l, cao nấm men 3g/l, NaCl 5g/l, agar 20g/l, tinh bột 20g/l, nước cất vừa đủ 1 lít và chuẩn pH =7-7,2.
- Chức năng: dùng để nhận diện những dòng vi khuẩn phân hủy tinh bột.
- Cách làm môi trường: tương tự như cách làm môi trường phân lập đĩa nhưng
phân phối khoảng 30ml trên mỗi đĩa petri (loại 80x15mm).
* Môi trƣờng LB (Luria Broth ) (Ronald, 2010)
- Thành phần: Tryptone 10g/l, NaCl 10g/l, cao nấm men 5g/l, nước cất vừa đủ 1lít và chuẩn pH =7-7,2.
- Dùng để nuôi tăng sinh vi khuẩn.
- Cách chuẩn bị môi trường: Cho một ít nước cất vào cốc thủy tinh. Bổ sung các
chất và nước cất đến thể tích cần dùng và khuấy cho tan hoàn toàn. Phân phối khoảng
4-5ml vào ống chịu nhiệt có nắp vặn 10ml rồi đem khử trùng.
*Môi trƣờng glucose - phosphate (Nguyễn Lân Dũng, 2014)
-Thành phần: Peptone 5g/l, glucose 5g/l, K2HPO4 5g/l, nước cất vừa đủ 1lít và chuẩn pH=7-7,2.
- Dùng để kiểm tra khả năng sinh acid của vi khuẩn khi môi trường có glucose. - Cách chuẩn bị môi trường: Tương tự như cách chuẩn bị môi tường LB.
3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
3.2.1. Phân lập vi khuẩn từ mẫu *Trãi mẫu *Trãi mẫu
- Pha loãng mẫu 102 lần, 10 3 lần, 104 lần và 105 lần.
- Trải đều 0,1ml mẫu ở các nồng độ lên môi trường phân lập đĩa bằng que trải thủy tinh.
*Cấy chuyển
- Khi khuẩn lạc phát triển, chọn những khuẩn lạc rời rạc tiến hành tách ròng bằng phương pháp cấy ria trên môi trường phân lập đĩa. Mỗi lần cấy chuyển đều ủ hiếu khí ở 30o
C trong 48giờ. Cấy chuyển cho đến khi xuất hiện những khuẩn lạc rời rạc có những đặc điểm giống nhau. Quan sát tế bào vi khuẩn trên kính hiển vi bằng phương pháp giọt ép (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2002) để kiểm tra sự đồng nhất của vi khuẩn dựa trên khuẩn lạc đã tách. Nếu đồng nhất thì kết luận vi khuẩn đã ròng. Đồng thời ghi nhận hình dạng của vi khuẩn.
- Dùng kính lúp để quan sát và ghi nhận các đặc điểm của khuẩn lạc vi khuẩn như hình dạng, độ nổi, dạng bìa, màu sắc, kích thước, trạng thái (ướt hay khô), sự mọc xuyên môi trường. Chụp hình khuẩn lạc để đối chứng.
- Trữ vi khuẩn ròng trong môi trường ống nghiêng. Các ống ròng được quấn parafilm để cách ly hoàn toàn với môi trường bên ngoài.
- Trước khi tiến hành bất cứ một thí nghiệm nào tiếp theo, mỗi ống ròng được
cấy truyền qua hai ống. Ủ ở 30oC trong 24 giờ đề vi khuẩn trong hai ống này phát triển.
Khi vi khuẩn đã phát triển thành khuẩn lạc, một ống sẽ được dùng trong thí nghiệm đó và ống còn lại được quấn parafilm để trữ.
3.2.2. Đo kích thƣớc vi khuẩn (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2002)
- Tìm trị số 1 khoảng của thước trắc vi thị kính
+ Đặt thước trắc vi vật kính vào bàn kính, điều chỉnh cho thấy rõ ảnh của thước. + Xê dịch thước trắc vi vật kính và xoay thước trắc vi thị kính sao cho 2 thước song song và gần sát nhau. Tiếp tục xê dịch thước trắc vi vật kính thế nào cho một vạch của thước trắc vi vật kính trùng với một vạch của thước trắc vi thị kính và một vạch thứ hai nào của thước trắc vi vật kính trùng với thước trắc vi thị kính.
+ Đếm số khoảng của thước trắc vi thị kính trùng với của thước trắc vi vật kính. + Gọi N là số khoảng của thước trắc vi vật kính trùng với n là số khoảng của thước trắc vi thị kính và x là trị số 1 khoảng của thước trắc vi thị kính thì x sẽ là:x =(N/n).10µm.
- Phương pháp đo
+ Thay thước trắc vi vật kính bằng mẫu vi khuẩn, điều chỉnh cho thấy rõ ảnh của vi khuẩn. Di chuyển mẫu để cho một đầu của mẫu trùng với một vạch của thước trắc
vi thị kính, từ đó tìm một vạch thứ hai trùng với đầu kia của mẫu đo. Đếm số khoảng thước trắc vi nằm trong hai vạch này.
+ Suy ra kích thước của tế bào vi khuẩn.
3.2.3. Kiểm tra khả năng di động của vi khuẩn (Nguyễn Lân Dũng, 2006) * Mục đích * Mục đích
Kiểm tra khả năng di động của vi khuẩn trong môi trường bán lỏng
* Cách tiến hành
- Dùng que cấy có đầu nhọn cấy vi khuẩn theo kiểu chích sâu vào môi trường bán lỏng. Mỗi nghiệm thức có ba lần lặp lại. Đối chứng là môi trường bán lỏng không chủng vi khuẩn.
- Đặt ống nghiệm thẳng đứng, ủ ở nhiệt độ thích hợp và quan sát sau 1-5 ngày.
* Ghi nhận kết quả
Vi khuẩn quanh vết cấy tức là chúng có khả năng di động. Vi khuẩn chỉ mọc theo vết cấy tức là chúng không có khả năng di động.
3.2.4. Nhuộm Gram (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2002) * Mục đích * Mục đích
Xác định vi khuẩn thuộc Gram âm hay Gram dương. Kết quả nhuộm Gram sẽ bổ sung cho kết quả giải trình tự gene vi khuẩn.
* Cách tiến hành
- Nhỏ 1 giọt nước cất đã khử trùng lên giữa lame.
- Dùng que cấy lấy một ít vi khuẩn rồi cho vào giọt nước.
- Hơ nóng mặt dưới của lame trên ngọn lửa đèn cồn để cố định vi khuẩn. - Nhỏ 1-2 giọt Crystal Violet từ mẫu đã cố định, để 2 phút.
- Rửa nước từ 2-3 giây, chậm nhẹ cho khô bớt nước. - Nhỏ dung dịch Iod, để 1 phút.
- Rửa bằng nước cất, chậm nhẹ.
- Rửa bằng ethanol 70% thật nhanh để tẩy màu cho đến khi giọt ethanol cuối cùng không còn màu tím.
- Rửa bằng nước vài giây, chậm nhẹ bằng giấy thấm. - Nhỏ 1-2 giọt Safarine, để 1 phút.
- Quan sát dưới kính hiển vi.
- Quan sát dưới kính hiển vi có độ phóng đại 400 lần và ghi nhận Gram của vi khuẩn. Nếu mẫu vi khuẩn có màu tím xanh của Crystal violet là mẫu Gram dương, có màu hồng đỏ của Safarine là mẫu Gram âm.
3.2.5. Kiểm tra catalase * Mục đích * Mục đích
Xác định vi khuẩn hiếu khí hoặc kỵ khí.
* Cách tiến hành
Cấy vi khuẩn vào môi trường phân lập đĩa, nuôi ở 30oC trong 48 giờ để khuẩn lạc
vi khuẩn phát triển đầy đủ. Nhỏ 3 giọt H2O2 3% lên khuẩn lạc của vi khuẩn.
* Ghi nhận kết quả
Nếu sủi bọt là dương tính tức có khả năng sinh catalase, không có sủi bọt là âm tính tức không có khả năng sinh catalase. Hoạt tính catalase được đánh giá +, ++ hay +++.
3.2.6. Kiểm tra Methyl red * Mục đích * Mục đích
Xác định khả năng sinh acid của vi khuẩn trong môi trường.
* Cách tiến hành
Chủng vi khuẩn vào môi trường môi trường glucose-phosphate, ủ ở 30oC trên
máy lắc (120vòng/phút) trong 72-96giờ. Sau đó trộn đều bằng máy vortex và nhỏ 5 giọt thuốc thử Methyl red vào. Đối chứng là môi trường glucose-phosphate không có vi khuẩn.
* Quan sát kết quả
Nếu dương tính thì dung dịch có màu đỏ nhạt tức có sinh acid trong môi trường, còn âm tính thì dung dịch có màu vàng hoặc cam tức không sinh acid trong môi trường.
3.2.7. Thí nghiệm kiểm tra hoạt tính amylase (Nguyễn Lân Dũng, 2006) * Mục đích * Mục đích
Chọn ra những dòng vi khuẩn có hoạt tính amylase.
* Bố trí thí nghiệm
Mỗi dòng vi khuẩn là một nghiệm thức với 3 lần lặp lại. VD2 được dùng như đối
chứng dương (có hoạt tính amylase) và môi trường LB là đối chứng âm (không có hoạt tính amylase).
* Cách tiến hành
Đục lỗ và làm mới vi khuẩn:
- Dùng đầu côn thủy tinh để đục lỗ (đường kính 4 mm) trên đĩa môi trường kiểm tra hoạt tính amylase (Hình 15). Không để đầu côn chạm đáy đĩa petri. Sau đó úp
ngược, cho vào túi nylon buộc miệng, trữ qua đêm trong tủ ủ 30oC để loại bỏ những
đĩa bị nhiễm vi sinh vật từ môi trường bên ngoài.
- Dùng kim cấy đã khử trùng lấy một ít vi khuẩn trong ống ròng chủng vào môi
trường lỏng LB, đem ủ ở 30o
C trong 24 giờ để vi khuẩn sinh trưởng đến pha Log.
Hình 13: Vị trí các giếng trên môi trƣờng kiểm tra hoạt tính amylase
Chủng vi khuẩn vào giếng:
- Trộn đều vi khuẩn bằng máy vortex, dùng miropipet hút 20µl vi khuẩn và các
đối chứng cho vào các lỗ đục, đậy nấp đĩa, đem ủ ở 30o
C trong 96 giờ. Khi cho vào lỗ đục tránh không cho các giọt vi khuẩn rơi rớt hay tràn ra ngoài.
Nhỏ dung dịch Lugol:
- Trán đều dung dịch Lugol trên mặt môi trường của đĩa vi khuẩn, chờ phản ứng. Vùng tinh bột bị phân hủy xung quanh khuẩn lạc sẽ có màu sáng rõ vì không bắt màu với Lugol.
- Ghi nhận kết quả: đối chứng dương, đối chứng âm, đường kính khuẩn lạc (d), đường kính trung bình vòng halo (D), và chụp hình làm bằng chứng. Dương tính khi D/d >1, ngược lại là âm tính. Trong số những kết quả dương tính, chọn ra 2 dòng vi khuẩn có hoạt tính amylase mạnh nhất để khảo sát sự tăng trưởng của vi khuẩn theo thời gian và giải trình tự.
3.2.8. Sự tăng trƣởng của vi khuẩn theo thời gian * Mục đích
Xác định ảnh hưởng của mật số ban đầu đến sự sinh trưởng của vi khuẩn. Đồng thời xác định tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn. Tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn được xác định bởi công thức (Nguyễn Lân Dũng, 2006):
k = n/t
Trong đó:
k là tốc độ sinh trưởng (lần/giờ),
n là hệ số thế hệ (lần),
t là thời gian nuôi cấy (giờ).
Tốc độ sinh trưởng k càng lớn thì vi khuẩn sinh trường càng nhanh. Để tính được
k ta cần có n. Để tìm n, ta dựa vào mật số vi khuẩn trước (N0)và sau nuôi cấy (Nt). Cụ
thể ta dùng công thức sau:
Nt = N0.2n . Suy ra n = (logNt – logN0)/log2
Trong đó:
n là hệ số thế hệ (lần),
N0: là mật số ban đầu của vi khuẩn (số vi khuẩn/ml),
Nt: là mật số của vi khuẩn sau t giờ nuôi cấy (số vi khuẩn/ml).
* Bố trí thí nghiệm Bảng 2: Bố trí thí nghiệm xác định mật số vi khuẩn Nghiệm thức Lặp lại Mật số ban đầu (N0) Mật số sau 12 giờ nuôi (N12) Mật số sau 24 giờ nuôi (N24) Mật số sau 36 giờ nuôi (N36) VK1 Pha loãng 1 3 Pha loãng 2 Pha loãng 3 VK2 Pha loãng 1 3 Pha loãng 2 Pha loãng 3
* Cách tiến hành
- Vi khuẩn được nuôi trong môi trường LB ở nhiệt độ 30oC trong 24 giờ. Mật số ban đầu được xác định tại thời điểm vi khuẩn vừa được chủng vào môi trường LB.
- Pha loãng dung dịch chứa vi khuẩn đến các với các độ pha loãng khác nhau. Sau khi pha loãng dùng micropipette hút 5l dung dịch nhỏ vào đĩa petri chứa môi trường tinh bột đĩa (lặp lại 3 lần). Ủ vi khuẩn ở tủ ủ 30o
C trong 24 giờ.
* Ghi nhận kết quả
Đếm số khuẩn lạc xuất hiện trong đĩa sau khi nuôi ở từng độ pha loãng khác nhau và tính mật số vi sinh vật trong một đơn vị thể tích theo công thức:
Mật số (CFU/ml) = CFU x 1000 x độ pha loãng/5 CFU: số khuẩn lạc trung bình đếm được.
3.2.9. Khuếch đại vùng gene 16S rRNA * Mục đích * Mục đích
Khuếch đại vùng gene 16S rRNA của vi khuẩn đến một lượng cần thiết vừa đủ để diện di trên gel agarose và giải trình tự.
* Cách tiến hành
Quy trình ly trích DNA từ khuẩn lạc ròng
- Chọn 10 khuẩn lạc ròng cho vào tube eppendof 2,2ml. - Cho 1 viên bi sắt vào tube và lắc bằng máy lắc.
- Cho vào 1ml Lysis buffer, lắc đều, ủ ở nhiệt độ phòng trong 10phút. - Ly tâm 13000rpm/5phút, lấy phần dung dịch chuyển sang tube mới.
- Cho một lượng tương đương ethanol 95%, đảo nhẹ các ống tube, ủ 10phút ở nhiệt độ phòng sau đó ly tâm 13000 rpm/5phút, bỏ phần dung dịch phía trên.
- Rửa phần tủa bằng 500 µl ethanol 70%, ly tâm 13000 rpm/5phút. - Sấy khô chân không trong 10 phút.
- Hòa tan trong 100 µl TE 0,1X. - Trữ ở -20 oC.
Phản ứng khuếch đại DNA
- Khuếch đại DNA bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi27F-1492R (Lane, 1991): 27F- 5’-AGAGTTTAGTCCTTGGCTCAG- 3’
- Sau khi ly trích nhanh DNA của những dòng vi khuẩn được tuyển chọn, tiến