*Trãi mẫu
- Pha loãng mẫu 102 lần, 10 3 lần, 104 lần và 105 lần.
- Trải đều 0,1ml mẫu ở các nồng độ lên môi trường phân lập đĩa bằng que trải thủy tinh.
*Cấy chuyển
- Khi khuẩn lạc phát triển, chọn những khuẩn lạc rời rạc tiến hành tách ròng bằng phương pháp cấy ria trên môi trường phân lập đĩa. Mỗi lần cấy chuyển đều ủ hiếu khí ở 30o
C trong 48giờ. Cấy chuyển cho đến khi xuất hiện những khuẩn lạc rời rạc có những đặc điểm giống nhau. Quan sát tế bào vi khuẩn trên kính hiển vi bằng phương pháp giọt ép (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2002) để kiểm tra sự đồng nhất của vi khuẩn dựa trên khuẩn lạc đã tách. Nếu đồng nhất thì kết luận vi khuẩn đã ròng. Đồng thời ghi nhận hình dạng của vi khuẩn.
- Dùng kính lúp để quan sát và ghi nhận các đặc điểm của khuẩn lạc vi khuẩn như hình dạng, độ nổi, dạng bìa, màu sắc, kích thước, trạng thái (ướt hay khô), sự mọc xuyên môi trường. Chụp hình khuẩn lạc để đối chứng.
- Trữ vi khuẩn ròng trong môi trường ống nghiêng. Các ống ròng được quấn parafilm để cách ly hoàn toàn với môi trường bên ngoài.
- Trước khi tiến hành bất cứ một thí nghiệm nào tiếp theo, mỗi ống ròng được
cấy truyền qua hai ống. Ủ ở 30oC trong 24 giờ đề vi khuẩn trong hai ống này phát triển.
Khi vi khuẩn đã phát triển thành khuẩn lạc, một ống sẽ được dùng trong thí nghiệm đó và ống còn lại được quấn parafilm để trữ.
3.2.2. Đo kích thƣớc vi khuẩn (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2002)
- Tìm trị số 1 khoảng của thước trắc vi thị kính
+ Đặt thước trắc vi vật kính vào bàn kính, điều chỉnh cho thấy rõ ảnh của thước. + Xê dịch thước trắc vi vật kính và xoay thước trắc vi thị kính sao cho 2 thước song song và gần sát nhau. Tiếp tục xê dịch thước trắc vi vật kính thế nào cho một vạch của thước trắc vi vật kính trùng với một vạch của thước trắc vi thị kính và một vạch thứ hai nào của thước trắc vi vật kính trùng với thước trắc vi thị kính.
+ Đếm số khoảng của thước trắc vi thị kính trùng với của thước trắc vi vật kính. + Gọi N là số khoảng của thước trắc vi vật kính trùng với n là số khoảng của thước trắc vi thị kính và x là trị số 1 khoảng của thước trắc vi thị kính thì x sẽ là:x =(N/n).10µm.
- Phương pháp đo
+ Thay thước trắc vi vật kính bằng mẫu vi khuẩn, điều chỉnh cho thấy rõ ảnh của vi khuẩn. Di chuyển mẫu để cho một đầu của mẫu trùng với một vạch của thước trắc
vi thị kính, từ đó tìm một vạch thứ hai trùng với đầu kia của mẫu đo. Đếm số khoảng thước trắc vi nằm trong hai vạch này.
+ Suy ra kích thước của tế bào vi khuẩn.
3.2.3. Kiểm tra khả năng di động của vi khuẩn (Nguyễn Lân Dũng, 2006) * Mục đích * Mục đích
Kiểm tra khả năng di động của vi khuẩn trong môi trường bán lỏng
* Cách tiến hành
- Dùng que cấy có đầu nhọn cấy vi khuẩn theo kiểu chích sâu vào môi trường bán lỏng. Mỗi nghiệm thức có ba lần lặp lại. Đối chứng là môi trường bán lỏng không chủng vi khuẩn.
- Đặt ống nghiệm thẳng đứng, ủ ở nhiệt độ thích hợp và quan sát sau 1-5 ngày.
* Ghi nhận kết quả
Vi khuẩn quanh vết cấy tức là chúng có khả năng di động. Vi khuẩn chỉ mọc theo vết cấy tức là chúng không có khả năng di động.
3.2.4. Nhuộm Gram (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2002) * Mục đích * Mục đích
Xác định vi khuẩn thuộc Gram âm hay Gram dương. Kết quả nhuộm Gram sẽ bổ sung cho kết quả giải trình tự gene vi khuẩn.
* Cách tiến hành
- Nhỏ 1 giọt nước cất đã khử trùng lên giữa lame.
- Dùng que cấy lấy một ít vi khuẩn rồi cho vào giọt nước.
- Hơ nóng mặt dưới của lame trên ngọn lửa đèn cồn để cố định vi khuẩn. - Nhỏ 1-2 giọt Crystal Violet từ mẫu đã cố định, để 2 phút.
- Rửa nước từ 2-3 giây, chậm nhẹ cho khô bớt nước. - Nhỏ dung dịch Iod, để 1 phút.
- Rửa bằng nước cất, chậm nhẹ.
- Rửa bằng ethanol 70% thật nhanh để tẩy màu cho đến khi giọt ethanol cuối cùng không còn màu tím.
- Rửa bằng nước vài giây, chậm nhẹ bằng giấy thấm. - Nhỏ 1-2 giọt Safarine, để 1 phút.
- Quan sát dưới kính hiển vi.
- Quan sát dưới kính hiển vi có độ phóng đại 400 lần và ghi nhận Gram của vi khuẩn. Nếu mẫu vi khuẩn có màu tím xanh của Crystal violet là mẫu Gram dương, có màu hồng đỏ của Safarine là mẫu Gram âm.
3.2.5. Kiểm tra catalase * Mục đích * Mục đích
Xác định vi khuẩn hiếu khí hoặc kỵ khí.
* Cách tiến hành
Cấy vi khuẩn vào môi trường phân lập đĩa, nuôi ở 30oC trong 48 giờ để khuẩn lạc
vi khuẩn phát triển đầy đủ. Nhỏ 3 giọt H2O2 3% lên khuẩn lạc của vi khuẩn.
* Ghi nhận kết quả
Nếu sủi bọt là dương tính tức có khả năng sinh catalase, không có sủi bọt là âm tính tức không có khả năng sinh catalase. Hoạt tính catalase được đánh giá +, ++ hay +++.
3.2.6. Kiểm tra Methyl red * Mục đích * Mục đích
Xác định khả năng sinh acid của vi khuẩn trong môi trường.
* Cách tiến hành
Chủng vi khuẩn vào môi trường môi trường glucose-phosphate, ủ ở 30oC trên
máy lắc (120vòng/phút) trong 72-96giờ. Sau đó trộn đều bằng máy vortex và nhỏ 5 giọt thuốc thử Methyl red vào. Đối chứng là môi trường glucose-phosphate không có vi khuẩn.
* Quan sát kết quả
Nếu dương tính thì dung dịch có màu đỏ nhạt tức có sinh acid trong môi trường, còn âm tính thì dung dịch có màu vàng hoặc cam tức không sinh acid trong môi trường.
3.2.7. Thí nghiệm kiểm tra hoạt tính amylase (Nguyễn Lân Dũng, 2006) * Mục đích * Mục đích
Chọn ra những dòng vi khuẩn có hoạt tính amylase.
* Bố trí thí nghiệm
Mỗi dòng vi khuẩn là một nghiệm thức với 3 lần lặp lại. VD2 được dùng như đối
chứng dương (có hoạt tính amylase) và môi trường LB là đối chứng âm (không có hoạt tính amylase).
* Cách tiến hành
Đục lỗ và làm mới vi khuẩn:
- Dùng đầu côn thủy tinh để đục lỗ (đường kính 4 mm) trên đĩa môi trường kiểm tra hoạt tính amylase (Hình 15). Không để đầu côn chạm đáy đĩa petri. Sau đó úp
ngược, cho vào túi nylon buộc miệng, trữ qua đêm trong tủ ủ 30oC để loại bỏ những
đĩa bị nhiễm vi sinh vật từ môi trường bên ngoài.
- Dùng kim cấy đã khử trùng lấy một ít vi khuẩn trong ống ròng chủng vào môi
trường lỏng LB, đem ủ ở 30o
C trong 24 giờ để vi khuẩn sinh trưởng đến pha Log.
Hình 13: Vị trí các giếng trên môi trƣờng kiểm tra hoạt tính amylase
Chủng vi khuẩn vào giếng:
- Trộn đều vi khuẩn bằng máy vortex, dùng miropipet hút 20µl vi khuẩn và các
đối chứng cho vào các lỗ đục, đậy nấp đĩa, đem ủ ở 30o
C trong 96 giờ. Khi cho vào lỗ đục tránh không cho các giọt vi khuẩn rơi rớt hay tràn ra ngoài.
Nhỏ dung dịch Lugol:
- Trán đều dung dịch Lugol trên mặt môi trường của đĩa vi khuẩn, chờ phản ứng. Vùng tinh bột bị phân hủy xung quanh khuẩn lạc sẽ có màu sáng rõ vì không bắt màu với Lugol.
- Ghi nhận kết quả: đối chứng dương, đối chứng âm, đường kính khuẩn lạc (d), đường kính trung bình vòng halo (D), và chụp hình làm bằng chứng. Dương tính khi D/d >1, ngược lại là âm tính. Trong số những kết quả dương tính, chọn ra 2 dòng vi khuẩn có hoạt tính amylase mạnh nhất để khảo sát sự tăng trưởng của vi khuẩn theo thời gian và giải trình tự.
3.2.8. Sự tăng trƣởng của vi khuẩn theo thời gian * Mục đích
Xác định ảnh hưởng của mật số ban đầu đến sự sinh trưởng của vi khuẩn. Đồng thời xác định tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn. Tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn được xác định bởi công thức (Nguyễn Lân Dũng, 2006):
k = n/t
Trong đó:
k là tốc độ sinh trưởng (lần/giờ),
n là hệ số thế hệ (lần),
t là thời gian nuôi cấy (giờ).
Tốc độ sinh trưởng k càng lớn thì vi khuẩn sinh trường càng nhanh. Để tính được
k ta cần có n. Để tìm n, ta dựa vào mật số vi khuẩn trước (N0)và sau nuôi cấy (Nt). Cụ
thể ta dùng công thức sau:
Nt = N0.2n . Suy ra n = (logNt – logN0)/log2
Trong đó:
n là hệ số thế hệ (lần),
N0: là mật số ban đầu của vi khuẩn (số vi khuẩn/ml),
Nt: là mật số của vi khuẩn sau t giờ nuôi cấy (số vi khuẩn/ml).
* Bố trí thí nghiệm Bảng 2: Bố trí thí nghiệm xác định mật số vi khuẩn Nghiệm thức Lặp lại Mật số ban đầu (N0) Mật số sau 12 giờ nuôi (N12) Mật số sau 24 giờ nuôi (N24) Mật số sau 36 giờ nuôi (N36) VK1 Pha loãng 1 3 Pha loãng 2 Pha loãng 3 VK2 Pha loãng 1 3 Pha loãng 2 Pha loãng 3
* Cách tiến hành
- Vi khuẩn được nuôi trong môi trường LB ở nhiệt độ 30oC trong 24 giờ. Mật số ban đầu được xác định tại thời điểm vi khuẩn vừa được chủng vào môi trường LB.
- Pha loãng dung dịch chứa vi khuẩn đến các với các độ pha loãng khác nhau. Sau khi pha loãng dùng micropipette hút 5l dung dịch nhỏ vào đĩa petri chứa môi trường tinh bột đĩa (lặp lại 3 lần). Ủ vi khuẩn ở tủ ủ 30o
C trong 24 giờ.
* Ghi nhận kết quả
Đếm số khuẩn lạc xuất hiện trong đĩa sau khi nuôi ở từng độ pha loãng khác nhau và tính mật số vi sinh vật trong một đơn vị thể tích theo công thức:
Mật số (CFU/ml) = CFU x 1000 x độ pha loãng/5 CFU: số khuẩn lạc trung bình đếm được.
3.2.9. Khuếch đại vùng gene 16S rRNA * Mục đích * Mục đích
Khuếch đại vùng gene 16S rRNA của vi khuẩn đến một lượng cần thiết vừa đủ để diện di trên gel agarose và giải trình tự.
* Cách tiến hành
Quy trình ly trích DNA từ khuẩn lạc ròng
- Chọn 10 khuẩn lạc ròng cho vào tube eppendof 2,2ml. - Cho 1 viên bi sắt vào tube và lắc bằng máy lắc.
- Cho vào 1ml Lysis buffer, lắc đều, ủ ở nhiệt độ phòng trong 10phút. - Ly tâm 13000rpm/5phút, lấy phần dung dịch chuyển sang tube mới.
- Cho một lượng tương đương ethanol 95%, đảo nhẹ các ống tube, ủ 10phút ở nhiệt độ phòng sau đó ly tâm 13000 rpm/5phút, bỏ phần dung dịch phía trên.
- Rửa phần tủa bằng 500 µl ethanol 70%, ly tâm 13000 rpm/5phút. - Sấy khô chân không trong 10 phút.
- Hòa tan trong 100 µl TE 0,1X. - Trữ ở -20 oC.
Phản ứng khuếch đại DNA
- Khuếch đại DNA bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi27F-1492R (Lane, 1991): 27F- 5’-AGAGTTTAGTCCTTGGCTCAG- 3’
- Sau khi ly trích nhanh DNA của những dòng vi khuẩn được tuyển chọn, tiến hành PCR bằng máy PCR Perkin Elmer PE 9700 (Hoa Kỳ) với hai đoạn mồi nêu trên.
Bảng 3: Thành phần các chất trong một phản ứng PCR Thành phần 1 phản ứng (µl) Nước cất 2 lần 12,5 Buffer 10X 2,5 MgCl2 25mM 2 dNTP 4 Mồi xuôi 8F 1 Mồi ngược 1492R 1 Taq DNA po ymerase 0,25 DNA vi khuẩn 2 Tổng thể tích 25
- Phản ứng PCR gồm có các giai đoạn như sau:
Bảng 4: Các giai đoạn của phản ứng PCR Giai đoạn Tên giai đoạn Chu kỳ Nhiệt độ (oC) Thời gian
1 Biến tính 95oC 5 phút
2 Biến tính 95oC 30 giây
Bắt cặp 38 55oC 30 giây
Kéo dài 72oC 5 phút
3 Kéo dài 72oC 10 phút
- Sản phẩm PCR sẽ được dùng để diện di trên gel agarose 1,5% và gửi giải trình tự ở Hàn Quốc.
* Điện di sản phẩm PCR trên gel Agarose 1,5% (Trần Nhân Dũng, 2011)
- Chuẩn bị gel agarose 1,5% (giếng lớn) cần: 40ml TE 1X, 0,6g agarose, 0,8µl SafeView. Hòa tan agarose vào TE 1X trong chai nắp xanh, đậy kín nắp, sau đó nấu gel bằng microwave khoảng 4-5 phút, lấy ra để nguội khoảng 50°C (cầm vừa ấm tay), cho SafeView vào lắc nhẹ.
- Trong thời gian đợi gel nguội, lắp lược vào khuôn gel. Khi gel đã sẵn sàng, rót nhẹ vào góc dưới của khuôn, rót dứt khoát tránh bọt khí. Thông thường, gel được rót dày từ 0,5-1,0cm. Sau khoảng 45 phút gel đặc có màu trắng là sử dụng được.
- Load mẫu: Cắt một mẩu giấy paraffin, chia đều loading buffer lên trên (2µl/giọt). Lần lượt rút 0,8µl sản phẩm PCR, trộn nhẹ với giọt loading buffer bằng pipet (tránh làm gãy DNA) và load vào trong giếng. Thang chuẩn không cần load cùng với loading buffer. Lưu ý: trong quá trình load mẫu, sản phẩm PCR và loading buffer được đặt trên hộp đá.
- Sau khi load xong, đặt gel ngập dung dịch điện di. Điện di với hiệu điện thế thích hợp, 50V cho sản phẩm. Quá trình điện di được quan sát bởi sự di chuyển màu của loading buffer.
- Tắt nguồn điện khi vạch màu xanh của loading buffer đã di chuyển một khoảng cách thích hợp cho sự phân tách các đoạn DNA (thường là 2/3 gel).
- Dùng kẹp kẹp một đầu khay đựng gel, hơi nghiêng để loại bỏ hết dung dịch đệm (cẩn thận gel có thể trượt ra ngoài). Thấm nhẹ bề mặt dưới của khay và đem gel đi chụp hình.
3.2.10. Giải trình tự
- Sản phẩm PCR được gởi giải trình tự ở công ty Macrogen, Hàn Quốc .
- Kết quả giải trình tự các dòng vi khuẩn được so sánh độ tương đồng với các trình tự trên ngân hàng dữ liệu NCBI (National Center for Biotechnology Information) bằng chương trình BLASTN (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Kết hợp các kết quả nhuộm Gram, khả năng di động, v.v. để kết luận tên của các dòng vi khuẩn.
3.2.11. Xử lý số liệu thí nghiệm
Các số liệu thí nghiệm được xử lý thống kê bằng phần mềm Minitab 16 và Microsoft Excel 2010.
CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả phân lập và đặc điểm hình thái
4.1.1. Kết quả phân lập
Từ mẫu nước thải của lò bún Lệ Châu, 24 dòng vi khuẩn đã được phân lập trên môi trường chuyên biệt với nguồn carbon duy nhất là tinh bột (1%). Các dòng vi khuẩn này được ký hiệu theo thứ tự từ D1 đến D24.
Kết quả trải mẫu cho thấy mật số khuẩn lạc giảm dần từ đĩa trải mẫu với độ pha
loãng 10-2 đến 10-5. Các dòng vi khuẩn được phân lập từ các khuẩn lạc của 2 đĩa trải
mẫu với độ pha loãng 10-4 và 10-5 vì ở 2 đĩa này các khuẩn lạc mọc rời rạc với nhau.
Tất cả các dòng vi khuẩn đều ròng sau 3 đến 8 lần cấy chuyển.
4.1.2. Đặc điểm hình thái
a) Đặc điểm khuẩn lạc của 24 dòng vi khuẩn
Trên cùng một môi trường nuôi cấy các vi khuẩn khác nhau phát triển thành các khuẩn lạc khác nhau về một hoặc một số đặc điểm (Bảng 5).
Bảng 5: Đặc điểm khuẩn lạc của 24 dòng vi khuẩn đã phân lập đƣợc
STT Vi
khuẩn
Đặc điểm khuẩn lạc
Hình dạng Dạng bìa Độ nổi Màu sắc Đƣờng kính (mm)
1 D1 Tròn Nguyên Mô Trắng sữa 2 2 D2 Tròn Nguyên Lài Trắng sữa 2 3 D3 Tròn Nguyên Mô Trắng trong 1 4 D4 Tròn Nguyên Mô Trắng sữa 0,5 5 D5 Tròn Nguyên Mô Trắng sữa 2 6 D6 Tròn Nguyên Mô Trắng trong 1,5 7 D7 Không đều Răng cưa Lài Vàng nhạt 2 8 D8 Tròn Nguyên Lài Trắng trong 2 9 D9 Tròn Nguyên Phẳng Vàng nhạt 1 10 D10 Tròn Nguyên Lài Trắng trong 1,5 11 D11 Tròn Nguyên Lài Trắng trong 2 12 D12 Tròn Nguyên Mô Trắng sữa 2,5 13 D13 Tròn Nguyên Mô Trắng trong 2,5 14 D14 Tròn Nguyên Phẳng Trắng sữa 1,5 15 D15 Không đều Chia thùy Phẳng Trắng trong 2,5 16 D16 Không đều Răng cưa Lài Vàng nhạt 2,5 17 D17 Không đều Răng cưa Lài Vàng nhạt 2 18 D18 Tròn Nguyên Lài Trắng trong 2 19 D19 Tròn Nguyên Lài Vàng nhạt 1,5