2.9.1. Kỹ thuật PCR
PCR (Polymerase Chain Reaction) là kỹ thuật sinh học phân tử cho phép nhân bản một đoạn DNA mong muốn từ hệ gen DNA của cơ thể sinh vật thành nhiều bản sao. Kỹ thuật này được phát minh bởi Kary Mullis năm1958 tại công ty Cetus.
* Nguyên lý của kỹ thuật PCR
Kỹ thuật PCR tuân thủ những nguyên tác cơ bản của sao chép DNA trong cơ thể sinh vật:
- Dùng nhiệt độ cao tháo xoắn thay cho enzyme helicase.
- Kết hợp với enzyme DNA polymerase chịu nhiệt để tổng hợp DNA mới trong môi trường thích hợp.
- Hệ thống điều nhiệt thích hợp cùng với các đoạn mồi được thiết kế chuyên biệt chủ động.
Phương pháp PCR cho phép tổng hợp rất nhanh và chính xác từng đoạn DNA riêng biệt. Đây thực sự là phương pháp hiện đại và thuận tiện cho việc xác định sự có mặt của một gen nào đó trong tế bào với độ chính xác cao.
Một phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn: giai đoạn biến tính, giai đoạn bắt cặp, giai đoạn kéo dài:
- Giai đoạn biến tính (denaturation): tách chuỗi DNA từ sợi đôi thành 2 sợi đơn.
Nhiệt độ tăng lên 94-96oC để tách hai sợi DNA ra. Bước này gọi là biến tính vì nhiệt
độ tăng lên sẽ phá vỡ các liên kết hydro giữa hai mạch của phân tử DNA. Trước chu kỳ 1, DNA thường được biến tính đến thời gian mở chuỗi để đảm bảo mẫu DNA và mồi được phân tách hoàn toàn và chỉ còn dạng sợi đơn. Thời gian ở giai đoạn này khoảng 1-2 phút.
- Giai đoạn bắt cặp (annealing): gắn cặp mồi đặc trưng theo nguyên tắc bổ sung. Sau khi 2 sợi DNA tách ra, nhiệt độ được hạ xuống để mồi có thể gắn vào sợ DNA đơn. Nhiệt độ giai đoạn này phụ thuộc vào đoạn mồi và thường thấp hơn nhiệt độ biến
tính khoảng 45-60oC. Sử dụng sai nhiệt độ trong giai đoạn này dẫn đến việc đoạn mồi
không gắn hoàn toàn vào DNA mẫu, hay gắn một cách tùy tiện. Thời gian bắt cặp từ 1-2 phút.
- Giai đoạn kéo dài (extension): tổng hợp chuỗi DNA mới giống chuỗi DNA gốc. DNA polymerase gắn tiếp vào sợi trống. Nó bắt đầu bắm vào và hoạt động dọc theo sợi DNA. Nhiệt độ kéo dài phụ thuộc DNA polymerasse. Thời gian của bước này phụ thuộc vào cả DNA-polymerase và chiều dài mảnh DNA cần khuếch đại.
Các đoạn DNA mới được hình thành lại được sử dụng làm khuôn để tổng hợp cho các chu kỳ tiếp theo.
Như vậy số lượng bản sao sẽ tăng gấp 2 sau mỗi chu kỳ và sau n chu kỳ, tính
theo lý thuyết số lượng bản sao là 2n.
* Chu kỳ nhiệt:
Ba giai đoạn chính trong phản ứng PCR được lặp đi lặp lại nhiều lần (chu kỳ), thường từ 25 đến 75 chu kỳ cho đến khi kết thúc phản ứng.
2.9.2. Giải trình tự *Giới thiệu *Giới thiệu
Giải trình tự một phân tử DNA tức là phát hiện thứ tự sắp xếp của 4 loại nucleotides A (Adenine), C (Cytosine), G (guanine) và T (thymine) trên phân tử DNA đó.
* Phƣơng pháp hóa học của Maxam và Gilbert (1997)
Giải trình tự bằng phương pháp hóa học được Maxam và Gilbert tìm ra năm 1997. Phương pháp gồm có 4 bước:
- Đánh dấu một đầu của đoạn DNA cần phải giải trình tự bằng một gốc phospho
đồng vị phóng xạ (32
P).
- Xử lý các đoạn DNA đã đánh dấu này với chất hóa học có thể làm biến đổi đặc hiệu một hoặc hai base của nucleotide trên đoạn DNA. Các chất hóa học được dùng là dimethylsulphate (biến đổi G), hydrazine (biến đổi T và C), hỗn hợp hydrazine và NaCl (làm biến đổi C), acid (làm biến đổi G và A) và NaOH (biến đổi A và C). Như vậy, trong giai đoạn này phải dùng ít nhất 4 ống nghiệm và trong mỗi ống nghiệm, DNA được xử lý với một lượng rất giới hạn của một trong các chất hóa học nêu trên để mỗi ống nghiệm chỉ có chứa các đoạn DNA mà trên mỗi đoạn DNA này chỉ có một vị trí nucleotide đặc hiệu với chất hóa học là bị biến đổi.
- Các nucleotide bị biến đổi sẽ được lấy ra khỏi mạch khung đường phosphate
của đoạn DNA, nhờ đó tách ra được mạch đơn có một đầu đánh dấu 32P và một đầu bị
mất phân tử base vì phân tử này bị lấy ra khỏi mạch khung.
- Điện di mẫu DNA đã xử lý trong 4 ống nghệm trên 4 hàng của một gel polyacrylamide biến tính để các mạch đơn di chuyển trong gel không bị biến đổi trong quá trình diện di. Sau khi điện di, các mạch đơn sẽ bị dừng tại các vị trí khác nhau, tùy thuộc mạch đơn này dài ngắn khác nhau, theo suốt chiều dài của gel. Áp gel đã chạy điện di này lên một gel nhạy tia X, các vị trí dừng lại của các mạch đơn trên gel điện di
sẽ tạo thành các vạch trên film vì các vị trí này đều bị đánh dấu phóng xạ 32P. Từ các
vạch trên film, ta có thể đọc được trình tự của các nucleotide trong đoạn DNA.
Phương pháp hóa học rất khó thực hiện vì cần phải xác định khá nhiều thông số tối ưu cho thí nghiệm, nhất là phải xác định nồng độ giới hạn của các chất hóa học sao cho khi xử lí mẫu DNA thì trên mỗi đoạn DNA chỉ có một base bị biến đổi để ứng với
mỗi vị trí của base bị biến đổi thì sẽ có một mạch đơn có đánh dấu 32P được tách ra.
Chính vì sự phức tạp này mà phương pháp hóa học hiện nay ít được sử dụng.
* Phƣơng pháp phản ứng chuỗi của Sanger (1997)
Phương pháp gồm có 3 bước:
- Chèn các đoạn DNA cần phải giải trình tự vào một vector là phage hay plasmid tại một vị trí mà trình tự chuỗi của vị trí này đã được định rõ. Đưa các vector mang đoạn chèn này vào tế bào vi khuẩn để nhân bản. Sau đó tách chiết và tinh khiết các vector từ vi khuẩn để thành các vector tự do.
- Dùng các đoạn mồi bổ sung một cách đặc hiệu với trình tự của vector tại vị trí chèn đoạn. Thêm vào ống phản ứng DNA polymerase và 4 loại nucleotide tự do (dNTP) và một lượng rất giới hạn ddNTP. Phản ứng được thực hiện trong 4 ống và mỗi ống cho một loại ddNTP khác nhau. DNA polymerase sẽ kéo các dNTP vào để tổng hợp mạch đơn bổ sung với mạch DNA chèn trên vector và sự tổng hợp mạch đơn sẽ bị dừng lại tại vị trí mà ddNTP được kéo vào thay vì dNTP. Lý do sự tổng hợp bị dừng lại là vì ddNTP có cấu trúc hóa học bị mất đi gốc OH tại vị trí carbon thứ 3 của đường deoxyribose mà gốc OH ở vị trí này là nơi dNTP kế tiếp gắn vào . Nhờ vậy trong ống phản ứng có các mạch đơn DNA có chiều dài khác nhau tương ứng với các vị trí trình tự các nucleotide trên đoạn DNA gốc.
- Để giải trình từ người ta diện di DNA tổng hợp trên gel polyacrylamide biến
tính. Với phương pháp đánh dấu mồi hay các dNTP bằng các đồng vị phóng xạ 32P hay
35S thì sau khi điện di, cũng giống như phương pháp hóa học , người ta phát hiện các
vạch điện di bằng kỹ thuật xạ ký tự ghi và từ các vạch này giải được trình tự của đoạn DNA.
Phương pháp phản ứng chuỗi của Sanger có ưu điểm là nhanh chóng và đơn giản hơn nhiều so với phương pháp hóa học nên hiện nay phương pháp này được sử dụng rộng rãi.
* Giải trình tự bằng máy tự động (automatic sequencer)
Cấu tạo của một máy giải trình tự tự động gồm hai phần chính yếu: phần điện di với gel polyacrylamide và phần phát hiện các vạch điện di. Phần diện di có thể là một gel hay một ống mao quản chứa gel. Phần phát hiện vạch điện di là những con mắt cảm quan và một chùm tia laser đi qua trước nó. Nguyên tắc hoạt động của máy này là trong suốt quá trình điện di, mỗi khi có một vạch điện di đi qua chùm tia laser thì vạch điện di sẽ phát sáng lên và sự phát sáng này sẽ được con mắt cảm quang ghi nhận và lưu lại thành một đỉnh cường độ sáng trong biểu đồ. Từ các đỉnh của các cường độ sáng này máy sẽ so dòng của các đỉnh tương ứng với các màu để cuối cùng phân tích thành trình tự của đoạn DNA. Ngày nay, người ta có thể dùng 4 loại huỳnh quang khác nhau để đánh dấu 4 loại ddNTP, nhờ vậy phản ứng giải trình tự có thể thực hiện được chỉ trong một ống nghiệm và khi giải trình tự chỉ cần điện di trên một hàng mà không cần phải trên 4 hàng như trước đây.
CHƢƠNG 3. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Phƣơng tiện nghiên cứu
3.1.1. Địa điểm nghiên cứu và tiến độ thực hiện
Địa điểm thu mẫu: Địa điểm lấy mẫu là lò bún Lệ Châu (140, Đường Điện Biên
Phủ, Phường 6, TP. Sóc Trăng, Tỉnh Sóc Trăng).
Địa điểm nghiên cứu: phòng thí nghiệm Vi sinh vật, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ sinh học của trường Đại học Cần Thơ.
Luận văn được tiến hành trong 4 tháng (8/2014-11/2014).
3.1.2. Vật liệu
Mẫu nước thải từ quá trình sản xuất bún của lò bún Lệ Châu (140, Đường Điện
Biên Phủ, Phường 6, TP. Sóc Trăng, Tỉnh Sóc Trăng).
Yêu cầu khoa học: nước thải chứa nhiều tinh bột và lò bún này chưa từng sử dụng bất cứ chế phẩm vi sinh nào để xử lý nước thải.
Chọn lấy mẫu nước thải đang trong giai đoạn phân hủy. Lấy nước thải từ độ sâu 30-0cm.
Thu 500ml nước thải, trữ trong chai thủy tinh có nắp vặn vô trùng. Đặt chai chứa mẫu trong thùng xốp, cho nước đá vào để bảo quản mang về phòng thí nghiệm.
3.1.3. Dụng cụ và thiết bị 3.1.3.1. Dụng cụ 3.1.3.1. Dụng cụ
- Đĩa petri thủy tinh.
- Ống nghiệm chịu nhiệt có nắp vặn dung tích 10ml. - Que cấy thép, que trải thủy tinh.
- Đèn cồn.
- Ống đong nhựa 1000ml, ống đong thủy tinh 200ml.
- Micropipette 1000-5000µl, micropipette 100-1000µl, micropipette 20-200µl, micropipette 2-20µl.
- Các loại đầu côn nhựa chịu nhiệt, đầu côn thủy tinh chịu nhiệt. - Tube eppendorf .
- Chai thủy tinh chịu nhiệt có nắp vặn loại 1000ml, 500ml, 250ml và 100ml. - Lam và lamen.
- Cốc thủy tinh.
- Những dụng cụ thông dụng khác như túi nylon, rổ đựng, khay đựng, v.v..
3.1.3.2. Thiết bị
- Tủ cấy vô trùng.
- Nồi khử trùng nhiệt ướt. - Tủ ủ vi sinh vật. - Máy vortex. - Cân điện tử. -Máy đo pH. - Kính hiển vi quang học. - Máy lắc mẫu.
- Máy khuấy từ gia nhiệt. - Máy chụp hình kỹ thuật số.
3.1.4. Hóa chất và môi trƣờng 3.1.4.1. Hóa chất
*Hóa chất dùng trong thí nghiệm nhận diện vi khuẩn phân hủy tinh bột - Pepton, cao nấm men, agar, tinh bột.
- Thuốc thử lugol: I2 0.5g, KI 1g và nước cất vừa đủ 100ml.
* Hóa chất kiểm tra đặc tính sinh hóa - Dung dịch H2O2 3%.
- Thuốc thử Methyl red: Methyl red 0,1g, ethanol 95% 300ml vào nước cất vừa đủ 500ml.
* Hóa chất nhuộm Gram
- Dung dịch Iod: I2 1g, KI 2g, NaHCO3 (5%) 60ml và nước cất 24ml.
- Dung dịch fuchsin: fuchsin 1g, ethanol 95% 100ml, dung dịch phenol 5% 100ml.
- Phẩm nhuộm crystal violet:
+ Dung dịch A: crystal violet (85%) 20g, ethanol 95% 100ml.
+ Pha dung dịch A trong nước với tỷ lệ 1:10 ta có hỗn hợp C. Trộn B với C theo tỷ lệ 4:1 ta được phẩm nhuộm crystal violet.
- Dung dịch rượu tẩy màu crystal violet: ethanol 95% 250ml, aceton 250ml. - Ethanol 70%, Nước cất hai lần vô trùng.
*Hóa chất dùng để chuẩn pH - KOH 1M. - CH3COOH 1M. * Hóa chất khử trùng - Khử trùng tay: ethanol 70%. - Đèn cồn: ethanol 95%. 3.1.4.2. Môi trƣờng
*Môi trƣờng phân lập (Shengwei et al., 2012)
- Thành phần môi trường phân lập: K2HPO2 1,9g/l, KH2PO4 0,94g/l, KCl 1,6g/l,
NaCl 1,43g/l, NH4Cl 0,15g/l, MgSO4.7H2O 0,037g/l, CaCl2.2H2O 0,017g/l, tinh bột 10g/l, Agar 20g/l (3g/l cho môi trường bán lỏng), cyclohexamide 0,1g/l (khi trải mẫu), nước cất vừa đủ 1 lít, chuẩn pH =7-7,2.
- Chức năng: là môi trường chuyên biệt dùng để phân lập vi khuẩn phân hủy tinh bột với nguồn carbon là tinh bột.
- Cách chuẩn bị môi trường:
+ Môi trường đĩa: Cho một ít nước cất vào chai thủy tinh chịu nhiệt có nắp vặn. Hòa tan các khoáng chất và cao nấm men. Bổ sung tinh bột và agar. Cho nước cất đến thể tích cần dùng. Đun trên bếp từ gia nhiệt cho đến khi tinh bột chuyển thành dạng hồ hoàn toàn. Vặn nắp chai (không vặn quá chặt) và đem khử trùng nhiệt ướt ở 121oC, 1atm trong 20 phút, để nguội đến khoảng 80o
C rồi phân phối 15-20ml vào mỗi đĩa petri (loại 80x15 mm) (tiến hành trong tủ cấy vô trùng). Khi hơi nước bay hơi hết thì úp ngược, cho vào túi nylon buột miệng, trữ qua đêm trong tủ ủ ở 30oC để kiểm tra những đĩa bị nhiễm vi sinh vật từ môi trường bên ngoài.
+ Môi trường ống nghiêng: cách chuẩn bị cũng tương tự như môi trường phân lập đĩa nhưng phân phối khoảng 4-5ml vào ống chịu nhiệt có nắp vặn 10ml rồi mới
đem khử trùng. Khử trùng xong thì tiến hành nghiêng ống. Trữ qua đêm trong tủ ủ ở 30oC để kiểm tra những đĩa bị nhiễm vi sinh vật từ môi trường bên ngoài.
* Môi trƣờng kiểm tra hoạt tính amylase (Nguyễn Lân Dũng, 2006)
- Thành phần: Peptone 5g/l, cao nấm men 3g/l, NaCl 5g/l, agar 20g/l, tinh bột 20g/l, nước cất vừa đủ 1 lít và chuẩn pH =7-7,2.
- Chức năng: dùng để nhận diện những dòng vi khuẩn phân hủy tinh bột.
- Cách làm môi trường: tương tự như cách làm môi trường phân lập đĩa nhưng
phân phối khoảng 30ml trên mỗi đĩa petri (loại 80x15mm).
* Môi trƣờng LB (Luria Broth ) (Ronald, 2010)
- Thành phần: Tryptone 10g/l, NaCl 10g/l, cao nấm men 5g/l, nước cất vừa đủ 1lít và chuẩn pH =7-7,2.
- Dùng để nuôi tăng sinh vi khuẩn.
- Cách chuẩn bị môi trường: Cho một ít nước cất vào cốc thủy tinh. Bổ sung các
chất và nước cất đến thể tích cần dùng và khuấy cho tan hoàn toàn. Phân phối khoảng
4-5ml vào ống chịu nhiệt có nắp vặn 10ml rồi đem khử trùng.
*Môi trƣờng glucose - phosphate (Nguyễn Lân Dũng, 2014)
-Thành phần: Peptone 5g/l, glucose 5g/l, K2HPO4 5g/l, nước cất vừa đủ 1lít và chuẩn pH=7-7,2.
- Dùng để kiểm tra khả năng sinh acid của vi khuẩn khi môi trường có glucose. - Cách chuẩn bị môi trường: Tương tự như cách chuẩn bị môi tường LB.
3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
3.2.1. Phân lập vi khuẩn từ mẫu *Trãi mẫu *Trãi mẫu
- Pha loãng mẫu 102 lần, 10 3 lần, 104 lần và 105 lần.
- Trải đều 0,1ml mẫu ở các nồng độ lên môi trường phân lập đĩa bằng que trải thủy tinh.
*Cấy chuyển
- Khi khuẩn lạc phát triển, chọn những khuẩn lạc rời rạc tiến hành tách ròng bằng phương pháp cấy ria trên môi trường phân lập đĩa. Mỗi lần cấy chuyển đều ủ hiếu khí ở 30o
C trong 48giờ. Cấy chuyển cho đến khi xuất hiện những khuẩn lạc rời rạc có những đặc điểm giống nhau. Quan sát tế bào vi khuẩn trên kính hiển vi bằng phương pháp giọt ép (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2002) để kiểm tra sự đồng nhất của vi khuẩn dựa trên khuẩn lạc đã tách. Nếu đồng nhất thì kết luận vi khuẩn đã ròng. Đồng thời ghi nhận hình dạng của vi khuẩn.
- Dùng kính lúp để quan sát và ghi nhận các đặc điểm của khuẩn lạc vi khuẩn như hình dạng, độ nổi, dạng bìa, màu sắc, kích thước, trạng thái (ướt hay khô), sự mọc xuyên môi trường. Chụp hình khuẩn lạc để đối chứng.
- Trữ vi khuẩn ròng trong môi trường ống nghiêng. Các ống ròng được quấn parafilm để cách ly hoàn toàn với môi trường bên ngoài.
- Trước khi tiến hành bất cứ một thí nghiệm nào tiếp theo, mỗi ống ròng được
cấy truyền qua hai ống. Ủ ở 30oC trong 24 giờ đề vi khuẩn trong hai ống này phát triển.