3.6.1. Ảnh hưởng của A23187 và Ca2+ nội bào đến sự hình thành vi thể
Sự hình thành của vi thể đi kèm với sự phá vỡ phân bố bất đối xứng của thành phần lipid màng. Phosphatidyl serine (PS) vốn phân bố ở lớp màng trong sẽ được chuyển ra lớp màng ngoài bởi hoạt động của phospholipid scramblase. Khi cảm ứng tế bào bằng A23187, quá trình hình thành vi thểđược quan sát bằng huỳnh quang của protein Annexin V-FITC gắn đặc hiệu với PS trên bề mặt của tế bào và của vi thể. Sau khi đưa vào các điều kiện cảm ứng khác nhau bao gồm Ca2+ 2 mM khi có mặt A23187 ở nồng độ 2 µM. Ảnh hưởng của thời gian cảm ứng được khảo sát sau các khoảng thời gian khác nhau từ 30, 60, 90, 120 và 240 phút. Sau mỗi khoảng thời gian cảm ứng, tế bào được ủ với Anexin V-FITC trong dung dịch đệm Annexin binding buffer. Kết quả quan sát thấy vi thể bắt đầu hình thành sau 30 phút, sau đó lượng vi thể xuất hiện nhiều hơn và nhiều nhất sau 3 giờ sau thời điểm bắt
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 34 đầu cảm ứng. Việc phát hiện sự hình thành vi thể trên bề mặt màng tế bào bởi Annexin V-FITC được thể hiện trong Hình 3.12.
Hình 3.12. Cảm ứng hình thành vi thể bởi A23187 và Ca2+
Mũi tên đỏ chỉ các vi thể hình thành từ tế bào hồng cầu. Hình ảnh được chụp sau 60 phút cảm ứng tế bào hồng cầu bằng A23187 2 µM và Ca2+ 2 mM
3.6.2. Ảnh hưởng của LPA và Ca2+ nội bào đến sự hình thành vi thể
Để xác định ảnh hưởng của LPA tới sự hình thành vi thể từ tế bào hồng cầu, chúng tôi cũng đã tiến hành thí nghiệm với tế bào hồng cầu được nhuộm Anexin V- FITC. Với các tế bào hồng cầu trong dung dịch sinh lý với nồng độ Ca2+ 2mM, sau khi bổ sung LPA có nồng độ trong dung dịch là 2,5 µM là 5 phút đã có sự hình thành vi thể từ 1 số tế bào hồng cầu. Sau 15 phút, cường độ huỳnh quang từ các tế bào là cực đại, số lượng tế bào hồng cầu hình thành vi thể tăng nhiều (Hình 3.13).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 35
Hình 3.13. Cảm ứng hình thành vi thể bởi LPA và Ca2+
Mũi tên đỏ chỉ các vi thể hình thành từ tế bào hồng cầu. Hình ảnh được chụp sau 15 phút cảm ứng tế bào hồng cầu bằng LPA 2,5 µM và Ca2+ 2 mM
3.6.3. Ảnh hưởng PMA và Ca2+ nội bào đến sự hình thành vi thể
Tương tự,ảnh hưởng Ca2+ nội bào đến sự hình thành vi thể bởi PMA cũng được xác định. Trong thí nghiệm này, nồng độ PMA sử dụng là 6 µM. Tế bào hồng cầu sau khi được cảm ứng bởi PMA trong các khoảng thời gian khác nhau cũng được ủ với Anexin V-FITC. Kết quả cho thấy, khi cảm ứng bằng PMA, sự hình thành và giải phóng vi thể diễn ra chậm hơn. Sau 60 phút cảm ứng vi thể bắt đầu xuất hiện trên bề mặt màng tế bào nhưng số lượng thấp hơn nhiều so với cảm ứng bằng A23187 và LPA (Hình 3.14). Sự khác nhau này là do cơ chế tác động của PMA tới nồng độ Ca2+ nội bào. PMA không kích hoạt kênh vận chuyển Ca2+ mà chỉ kích hoạt protein kinase C. PMA không trực tiếp tham gia vào con đường vận chuyển Ca2+ từ bên ngoài vào tế bào mà chỉ có tác động gián tiếp thông qua kích hoạt protein kinase C dẫn đến hoạt hóa các protein khác.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 36
Hình 3.14. Cảm ứng hình thành vi thể bởi PMA và Ca2+
Mũi tên đỏ chỉ các vi thể hình thành từ tế bào hồng cầu. Hình ảnh được chụp sau 60 phút cảm ứng tế bào hồng cầu bằng PMA 6 µM và Ca2+ 2 mM.
3.7. Nghiên cứu phương pháp thu nhận vi thể
Tế bào hồng cầu được cảm ứng hình thành vi thể trong dung dịch đệm sinh lý có nồng độ Ca2+ 2 mM khi có mặt chất cảm ứng A23187 2 µM hoặc LPA 2,5 µM hoặc PMA 6 µM. Sau 2 giờ mẫu được ly tâm 3 lần ở tốc độ 3000 g trong 1 giờ ở 4ºC để loại bỏ tế bào và các thể apoptosis. Sau đó vi thểđược thu nhận bằng siêu ly tâm 50.000 g trong 1 giờ ở 4ºC. Vi thể thu được sau đó được gửi đi phân tích kích thước bằng máy Zetasizer Nano ZS. Dựa vào kết quả phân tích, chúng tôi đã xây dựng phương pháp thu nhận vi thể từ tế bào hồng cầu (Hình 3.15).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 37
Hình 3.15. Phương pháp thu nhận vi thể từ tế bào hồng cầu 3.8. Xác định kích thước của vi thể
Hiện nay việc xác định kích thước các cấu trúc nano bằng các thiết bị thông thường rất khó khăn. Do vi thể rất nhỏ có kích thước trong phạm vi 0,1 đến 1 µM nên chỉ có thể sử dụng các máy chuyên dụng như kính hiển vi điện tử SEM, AFM. Trong nghiên cứu này, các mẫu vi thểđược gửi phân tích bằng máy Zetasizer Nano ZS (Đại học Aston, Vương quốc Anh).
Kết quả phân tích cho thấy kích thước vi thể thu được có sự khác nhau. Kích thước trung bình của các vi thể thu được dao động trong khoảng từ 150 đến 500 nm tùy thuộc vào điều kiện cảm ứng và thời gian cảm ứng (Bảng 1).
Bảng 1. Kích thước vi thể Chất cảm ứng Phạm vi kích thước vi
thể (nm) Kích thước trung bình của vi thể (nm)
A23187 2µM 150-500 190 ± 42
LPA 2,5 µM 135-350 168 ± 34
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 38 Trong một số trường hợp các vi thể giải phóng khỏi tế bào có thể phân bố thành các phân đoạn có kích thước rất khác nhau. Tuy nhiên, phần lớn kết quả thu được các vi thể có đỉnh nằm trong phạm vi từ 100 đến 200 nm (Hình 3.16).
Hình 3.16. Kích thước của vi thể đo bằng máy Zetasizer Nano
Cho đến nay, trong các thí nghiệm chuyển gene sử dụng các cấu trúc có bản chất phospholipid như liposome hoặc các dạng lipofectin, kích thước tốt nhất của các cấu trúc mang axit nucleic (DNA, mRNA hoặc các miRNA) cần trong phạm vi 100 nm. Với kích thước này, vi thể thu được có thểđược sử dụng để nghiên cứu khả năng mang axit nucleic, đánh giá khả năng dung hợp màng và chuyển gene vào tế bào.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 39
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận
Khi xử lí tế bào hồng cầu người với A23187 2 µM hoặc LPA 2,5 µM hoặc PMA 6 µM đều dẫn đến sự gia tăng Ca2+ nội bào. Với mỗi chất cảm ứng khác nhau thì thời gian làm nồng độ Ca2+ nội bào tăng là khác nhau, cụ thể với LPA nồng độ Ca2+ tăng diễn ra tức thời (sau 45-60 giây đạt cực đại) và thời gian phản ứng chậm nhất là khi xử lý tế bào hồng cầu với PMA (sau 20 phút đạt cực đại).
Bằng cách sử dụng các kỹ thuật đánh dấu huỳnh quang, kính hiển vi huỳnh quang thì nồng độ Ca2+ nội bào, sự hình thành và giải phóng MV khỏi tế bào hồng cầu đã được nghiên cứu.
Các vi thể có thể thu nhận bằng phương pháp ly tâm. Kích thước trung bình của vi thể tạo thành tương ứng với chất cảm ứng kèm theo Ca2+ 2 mM là: 190 ± 42 nm (A23187 2µM); 168 ± 34 nm (LPA 2,5 µM); 276 ± 35 nm (PMA 6 µM)
Điều kiện cảm ứng tối ưu nhất để tạo vi thể từ tế bào hồng cầu phục vụ cho các nghiên cứu kế tiếp là xử lí tế bào hồng cầu với LPA 2,5 µM, Ca2+ 2mM. Ở điều kiện cảm ứng này, thời gian vi thể được tạo thành ngắn hơn và kích thước trung bình vi thể tạo thành nhỏ nhất (168 ± 34 nm ). Bởi cho đến nay, trong các thí nghiệm chuyển gene sử dụng các cấu trúc có bản chất phospholipid như liposome hoặc các dạng lipofectin, kích thước tốt nhất của các cấu trúc mang axit nucleic (DNA, mRNA hoặc các miRNA) cần trong phạm vi 100 nm
2. Kiến nghị
Các kết quả thu được từ đề tài rất hữu ích cho các nghiên cứu sinh học cơ bản, góp phần giải thích các cơ chế dẫn đến sự hình thành của các vi thể ở hồng cầu cũng như các dạng tế bào khác trong các quá trình sinh lý và bệnh. Dựa trên các kết quả thu được, các vi thể giải phóng từ tế bào hồng cầu có thể được thu
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 40 thập cho các nghiên cứu tiếp theo xác định đặc tính và chức năng từ đó có thể sử dụng vi thể làm công cụ vận chuyển protein, nucleic acid hoặc vận chuyển thuốc đến các tế bào đích.
Do những hạn chế về thời gian, điều kiện trang thiết bị, cần có những nghiên cứu kế tiếp để làm rõ hơn về ảnh hưởng của Ca2+ tới sự hình thành cấu trúc vi thể, xác định các đặc điểm của vi thể, khả năng mang protein, nucleic acid và dung hợp với các tế bào khác nhau.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 41
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ
1. Role of intracellular Ca2+ on the formation of microvesicle in human red
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Anderson, H. C., Garımella, R. & Tague, S. E. 2005. The role of matrix vesicles in growth plate development and biomineralization. Front Biosci, 10, 822-37.
Andrews, R. K. & Berndt, M. C. 2004. Platelet physiology and thrombosis. Thromb Res,
114, 447-53.
Antwı-Baffour, S., Kholıa, S., Aryee, Y. K., Ansa-Addo, E. A., Stratton, D., Lange, S. & Inal, J. M. 2010. Human plasma membrane-derived vesicles inhibit the phagocytosis of apoptotic cells--possible role in SLE. Biochem Biophys Res Commun, 398, 278-83.
Barry, O. P., Kazanıetz, M. G., Pratıco, D. & Fıtzgerald, G. A. 1999. Arachidonic acid in platelet microparticles up-regulates cyclooxygenase-2-dependent prostaglandin formation via a protein kinase C/mitogen-activated protein kinase-dependent pathway. J Biol Chem, 274, 7545-56.
Barry, O. P., Pratıco, D., Lawson, J. A. & Fıtzgerald, G. A. 1997. Transcellular activation of platelets and endothelial cells by bioactive lipids in platelet microparticles. J Clin
Invest, 99, 2118-27.
Barteneva, N. S., Fasler-Kan, E., Bernımoulın, M., Stern, J. N., Ponomarev, E. D., Duckett, L. & Vorobjev, I. A. 2013. Circulating microparticles: square the circle. BMC Cell
Biol, 14, 23.
Bevers, E. M., Comfurıus, P., Dekkers, D. W. & Zwaal, R. F. 1999. Lipid translocation across the plasma membrane of mammalian cells. Biochim Biophys Acta, 1439,
317-30.
Buckı, R., Bachelot-Loza, C., Zachowskı, A., Gıraud, F. & Sulpıce, J. C. 1998. Calcium induces phospholipid redistribution and microvesicle release in human erythrocyte membranes by independent pathways. Biochemistry, 37, 15383-91.
Cocuccı, E., Racchettı, G. & Meldolesı, J. 2009. Shedding microvesicles: artefacts no more.
Trends Cell Biol, 19, 43-51.
D'souza-Schorey, C. & Clancy, J. W. 2012. Tumor-derived microvesicles: shedding light on novel microenvironment modulators and prospective cancer biomarkers. Genes Dev, 26, 1287-99.
Dasgupta, S. K., Abdel-Monem, H., Nıravath, P., Le, A., Bellera, R. V., Langloıs, K., Nagata, S., Rumbaut, R. E. & Thıagarajan, P. 2009. Lactadherin and clearance of platelet-derived microvesicles. Blood, 113, 1332-9.
De Vooght, K. M., Lau, C., De Laat, P. P., Van Wıjk, R., Van Solınge, W. W. & Schıffelers, R. M. 2013. Extracellular vesicles in the circulation: are erythrocyte microvesicles a confounder in the plasma haemoglobin assay? Biochem Soc Trans, 41, 288-92.
Del Conde, I., Shrımpton, C. N., Thıagarajan, P. & Lopez, J. A. 2005. Tissue-factor- bearing microvesicles arise from lipid rafts and fuse with activated platelets to initiate coagulation. Blood, 106, 1604-11.
Deregıbus, M. C., Cantaluppı, V., Calogero, R., Lo Iacono, M., Tetta, C., Bıancone, L., Bruno, S., Bussolatı, B. & Camussı, G. 2007. Endothelial progenitor cell derived
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 43 microvesicles activate an angiogenic program in endothelial cells by a horizontal transfer of mRNA. Blood, 110, 2440-8.
Elmore, S. 2007. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicol Pathol, 35, 495- 516.
Fackler, O. T. & Peterlın, B. M. 2000. Endocytic entry of HIV-1. Current Biology, 10,
1005-1008.
Fevrıer, B., Vılette, D., Archer, F., Loew, D., Faıgle, W., Vıdal, M., Laude, H. & Raposo, G. 2004. Cells release prions in association with exosomes. Proc Natl Acad Sci U S
A, 101, 9683-8.
Graham, T. R. 2004. Flippases and vesicle-mediated protein transport. Trends in Cell Biology, 14, 670-677.
Gyorgy, B., Szabo, T. G., Pasztoı, M., Pal, Z., Mısjak, P., Aradı, B., Laszlo, V., Pallınger, E., Pap, E., Kıttel, A., Nagy, G., Falus, A. & Buzas, E. I. 2011. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cell Mol Life Sci,
68, 2667-88.
Holoch, D. & Moazed, D. 2015. RNA-mediated epigenetic regulation of gene expression.
Nat Rev Genet, 16, 71-84.
Huebner, A. R., Somparn, P., Benjachat, T., Leelahavanıchkul, A., Avıhıngsanon, Y., Fenton, R. A. & Pısıtkun, T. 2015. Exosomes in urine biomarker discovery. Adv Exp Med Biol, 845, 43-58.
Hugel, B., Martınez, M. C., Kunzelmann, C. & Freyssınet, J. M. 2005. Membrane microparticles: two sides of the coin. Physiology (Bethesda), 20, 22-7.
Kaestner, L., Tabellıon, W., Weıss, E., Bernhardt, I. & Lıpp, P. 2006. Calcium imaging of individual erythrocytes: problems and approaches. Cell Calcium, 39, 13-9.
Knowles, D. W., Tılley, L., Mohandas, N. & Chasıs, J. A. 1997. Erythrocyte membrane vesiculation: Model for the molecular mechanism of protein sorting. Proc Natl Acad Sci U S A, 94, 12969-74.
Kotowıcz, K., Dıxon, G. L., Kleın, N. J., Peters, M. J. & Callard, R. E. 2000. Biological function of CD40 on human endothelial cells: costimulation with CD40 ligand and interleukin-4 selectively induces expression of vascular cell adhesion molecule-1 and P-selectin resulting in preferential adhesion of lymphocytes. Immunology, 100,
441-8.
Lang, K. S., Duranton, C., Poehlmann, H., Myssına, S., Bauer, C., Lang, F., Wıeder, T. & Huber, S. M. 2003. Cation channels trigger apoptotic death of erythrocytes. Cell Death Differ, 10, 249-56.
Lee, T. H., D'astı, E., Magnus, N., Al-Nedawı, K., Meehan, B. & Rak, J. 2011. Microvesicles as mediators of intercellular communication in cancer--the emerging science of cellular 'debris'. Semin Immunopathol, 33, 455-67.
Losche, W., Scholz, T., Temmler, U., Oberle, V. & Claus, R. A. 2004. Platelet-derived microvesicles transfer tissue factor to monocytes but not to neutrophils. Platelets,
15, 109-15.
Ludwıg, A. K. & Gıebel, B. 2012. Exosomes: small vesicles participating in intercellular communication. Int J Biochem Cell Biol, 44, 11-5.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 44 Mandal, D., Mazumder, A., Das, P., Kundu, M. & Basu, J. 2005. Fas-, caspase 8-, and caspase 3-dependent signaling regulates the activity of the aminophospholipid translocase and phosphatidylserine externalization in human erythrocytes. J Biol Chem, 280, 39460-7.
Manno, S., Takakuwa, Y. & Mohandas, N. 2002. Identification of a functional role for lipid asymmetry in biological membranes: Phosphatidylserine-skeletal protein interactions modulate membrane stability. Proc Natl Acad Sci U S A, 99, 1943-8. Mıyamoto, S., Kowalska, M. A., Marcınkıewıcz, C., Marcınkıewıcz, M. M., Mosser, D.,
Edmunds, L. H., Jr. & Nıewıarowskı, S. 1998. Interaction of leukocytes with platelet microparticles derived from outdated platelet concentrates. Thromb Haemost, 80, 982-8.
Mohandas, N., Clark, M. R., Jacobs, M. S. & Shohet, S. B. 1980. Analysis of factors regulating erythrocyte deformability. J Clin Invest, 66, 563-73.
Nguyen, D. B., Wagner-Brıtz, L., Maıa, S., Steffen, P., Wagner, C., Kaestner, L. & Bernhardt, I. 2011. Regulation of phosphatidylserine exposure in red blood cells.
Cell Physiol Biochem, 28, 847-56.
Orrenıus, S., Zhıvotovsky, B. & Nıcotera, P. 2003. Regulation of cell death: the calcium- apoptosis link. Nat Rev Mol Cell Biol, 4, 552-65.
Ouyang, L., Shı, Z., Zhao, S., Wang, F. T., Zhou, T. T., Lıu, B. & Bao, J. K. 2012. Programmed cell death pathways in cancer: a review of apoptosis, autophagy and programmed necrosis. Cell Prolif, 45, 487-98.
Polgar, J., Matuskova, J. & Wagner, D. D. 2005. The P-selectin, tissue factor, coagulation triad. J Thromb Haemost, 3, 1590-6.
Raposo, G. & Stoorvogel, W. 2013. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol, 200, 373-83.
Ratajczak, J., Wysoczynskı, M., Hayek, F., Janowska-Wıeczorek, A. & Ratajczak, M. Z. 2006. Membrane-derived microvesicles: important and underappreciated mediators of cell-to-cell communication. Leukemia, 20, 1487-95.