- Mỗi thí nghiệm được phân tích 3 lần với các mẫu máu khác nhau để lấy giá trị trung bình.Trong mỗi thí nghiệm đo cường độ huỳnh quang, số liệu phân tích được xác định từ kết quả đo 15 đến 30 tế bào riêng rẽ. Sai số được tính theo hàm STDEV của chương trình Excel 2013.
- Cường độ huỳnh quang thực (F) được xác định bằng giá trị huỳnh quang đo được ở mỗi tế bào (F1) trừđi giá trị huỳnh quang của nền kính hiển vi trường (F0).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 24
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Xây dựng thang chuẩn Ca2+ nội bào
Để xác định được nồng độ Ca2+ nội bào trong các thí nghiệm, một thang chuẩn Ca2+được xây dựng dựa trên cơ sở đo cường độ huỳnh quang tương ứng với nồng độ Ca2+đã biết trước nồng độ. Tế bào hồng cầu sau khi được ủ với Fluo-4 sẽ được đưa dung dịch đệm sinh lý có nồng độ Ca2+ ngoại bào ở các nồng độ 0 (đối chứng); 0,05; 0,1; 0,2; 0,5; 1; 5; 50; 100; 1000 và 2000 µM. Sau khi ủ với A23187 10 µM sẽ xảy ra quá trình cân bằng động về sự vận chuyển của Ca2+ từ bên ngoài vào trong tế bào và hoạt động bơm Ca2+ từ bên trong tế bào ra ngoài thông qua bơm Ca2+. Sau 10 phút khi nồng độ Ca2+ nội bào cân bằng tương ứng với nồng độ Ca2+ ngoại bào, cường độ huỳnh quang Fluo-4 được xác định để xây dựng thang chuẩn
(Hình 3.1).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 25
3.2. Xác định nồng độ Ca2+ nội bào ở điều kiện sinh lý
Để xác định nồng độ Ca2+ nội bào trong điều kiện sinh lý, tế bào sau khi ủ với Fluo-4 được đưa vào dung dịch đệm sinh lý với nồng độ Ca2+ ngoại bào 2 mM. Cường độ huỳnh quang của mỗi một tế bào hồng cầu được phân tích bằng cách sử dụng kính hiển vi huỳnh quang. Cường độ huỳnh quang thực sẽ được xác định sau khi trừ giá trị nền của kính hiển vi trường. Trong điều kiện sinh lý (đối chứng), cường độ huỳnh quang của các tế bào hồng cầu rất thấp và ổn định, không có sự thay đổi đáng kể trong thời gian 20 phút quan sát (Hình 3.2), chứng tỏ không có sự gia tăng nồng độ Ca2+ nội bào mặc dù nồng độ Ca2+ ngoại bào là 2 mM. Kết quả này là do hoạt động của bơm canxi đã đẩy Ca2+ ra khỏi tế bào. Do ở điều kiện bình thường, tế bào hồng cầu có nồng độ Ca2+ nội bào rất thấp, luôn được ổn định bởi hoạt động của bơm Ca2+.
Hình 3.2.Tế bào hồng cầu ở điều kiện sinh lý
Hình ảnh tế bào hồng cầu sau 20 phút quan sát ởđiều kiện sinh lý
Dòng Ca2+đi vào và ra khỏi tế bào (Ca2+ flux) được biểu diễn dưới dạng các đường trong Hình 3.3.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 26
Hình 3.3. Nồng độ Ca2+ nội bào ở điều kiện sinh lý
Mỗi đường thể hiện sự dao động của nồng độ Ca2+ nội bào của mỗi tế bào đơn. Thí nghiệm được đo liên tục trong thời gian 20 phút
Kết quả phân tích cường độ huỳnh quang Fluo-4 cho thấy, giá trị cường độ huỳnh quang trung bình của các tế bào là 35,4 đơn vị. So sánh với thang chuẩn, nồng độ Ca2+ trong tế bào ở điều kiện sinh lý rất thấp (<50 nM). Kết quả này cũng phù hợp với các nghiên cứu xác định nồng độ Ca2+ nội bào ở tế bào hồng cầu
3.3. Ảnh hưởng của A23187 đến nồng độ Ca2+ nội bào
Khi tiến hành thí nghiệm với sự có mặt của Ca2+ ionophore (A23187) cho phép vận chuyển Ca2+ vào trong tế bào, kết quả cho thấy khi bổ sung A23187 ở nồng độ 2 µM, sau 3-5 phút có sự tăng rất nhanh cường độ huỳnh quang ở các tế bào. Điều này chứng tỏ Ca2+ đã đi vào trong tế bào và làm tăng nồng độ Ca2+ nội bào (Hình 3.4). Khi xử lý tế bào với A23187, thời gian phản ứng của tế bào và nồng độ của Ca2+ nội bào phụ thuộc vào nồng độ Ca2+ ngoại bào và nồng độ A23187.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 27
Hình 3.4. Sự thay đổi cường độ huỳnh quang Fluo-4
Bên trái: Bắt đầu thí nghiệm.
Bên phải: Sau 10 phút xử lý tế bào bằng A23187 ở nồng độ 2 µM
Trên thực tế, nồng độ Ca2+ nội bào chỉ tăng đến một ngưỡng nhất định khi sử dụng Fluo-4 đểđịnh lượng. Điều này có thể do bản thân Fluo-4 đạt đến ngưỡng bão hòa về cường độ huỳnh quang khi nồng độ Ca2+ đạt mức giới hạn (> 100 µM). Ngoài ra, sự hoạt động của bơm Ca2+ trên màng tế bào cho phép duy trì nồng độ Ca2+ nội bảo ở ngưỡng nhất định.
Khi xử lý tế bào với A23187 với nồng độ Ca2+ ngoại bào 2 mM, sau 10 phút cường độ huỳnh quang đạt mức tối đa. So sánh với thang chuẩn, khi đó nồng độ Ca2+ nội bào nằm trong khoảng 50-100 µM (Hình 3.5)
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 28
Hình 3.5. Ảnh hưởng của A23187 đến nồng độ Ca2+ nội bào
(Nồng độ Ca2+ nội bào được xác định thông qua cường độ huỳnh quang Fluo-4)
3.4. Ảnh hưởng của LPA đến nồng độ Ca2+ nội bào
Trong thí nghiệm này, ảnh hưởng của LPA đến hàm lượng Ca2+ nội bào được khảo sát. Các nồng độ LPA khác nhau (từ 1- 10µM) được sử dụng để khảo sát phản ứng của tế bào với LPA. Kết quả cho thấy khi nồng độ LPA > 5 µM xảy ra hiện tượng vỡ tế bào hoàn toàn sau 15 phút ở nhiệt độ phòng. Ở nồng độ LPA 2,5 µM xảy ra hiện tượng vỡ tế bào, số lượng tế bào bị vỡ tăng dần theo thời gian.
Ảnh hưởng của LPA đến nồng độ Ca2+ nội bào được tiến hành với các tế bào hồng cầu đã chứa Fluo-4. Tế bào được đưa vào dung dịch đệm sinh lý có nồng độ Ca2+ ngoại bào 2 mM. Khi tế bào lắng xuống đáy đĩa, LPA được bổ sung với nồng độ cuối là 2,5 µM và trộn nhẹ nhàng bằng pipet. Mẫu được đo ngay khi LPA được bổ sung vào mẫu.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 29 Kết quả cho thấy ngay khi bổ sung LPA, cường độ huỳnh quang của tế bào hồng cầu sau khi được bổ sung LPA tăng nhanh chóng, sau 45-60 giây. Chứng tỏ sự gia tăng Ca2+ nội bào khi có mặt LPA diễn ra tức thời (Hình 3.6)
Hình 3.6. Ảnh hưởng của LPA tới nồng độ Ca2+ nội bào
Bên trái: Trước khi bổ sung LPA Bên phải: Sau khi bổ sung LPA 2,5 µM 1 phút. Mũi tên đỏ chỉ cùng một tế bào hồng cầu ở hai thời điểm quan sát
Sự biến động về nồng độ Ca2+ nội bào được thể hiện trong Hình 3.7. Cường độ huỳnh quang trong các tế bào rất cao ngay trong 5 phút đầu tiên sau đó giảm dần. Ở nồng độ LPA 2,5 µM giá trị huỳnh quang trung bình đo được ở các tế bào sau 10 phút là 250 ± 23 đơn vị (Hình 3.8). So sánh với đường chuẩn, nồng độ Ca2+ nội bào khi xử lý tế bào bằng LPA sau 10 phút trong khoảng từ 50-100 µM. So với tế bào ở trạng thái nghỉ (điều kiện sinh lý), nồng độ Ca2+ nội bào tăng hơn 1000 lần.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 30
Hình 3.7. Biến động của Ca2+ nội bào bởi LPA
Mỗi đường thể hiện sự dao động của nồng độ Ca2+ nội bào của mỗi tế bào đơn. Thí nghiệm được đo liên tục trong 20 phút
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 31
3.5. Ảnh hưởng của PMA đến nồng độ Ca2+ nội bào
PMA là chất kích hoạt cho họ protein kinase C (PKC). PKC là một họ lớn các protein tham gia vào điều khiển chức năng của nhiều protein khác thông quá phosphoryl hóa các nhóm hydroxyl của serine và threonine của các protein này. Vì vậy PKC đóng vai trò quan trọng trong các chuỗi truyền tín hiệu trong tế bào và ảnh hưởng đến nhiều quá trình sinh học khác.
Để khảo sát ảnh hưởng của PMA tới nồng độ Ca2+ nội bào, thí nghiệm đã được tiến hành với các tế bào hồng cầu có chứa Fluo-4. Huyền phù tế bào trong dung dịch đệm sinh lý có nồng độ Ca2+ 2mM. Tương tự như thí nghiệm với LPA, sau khi tế bào lắng xuống đáy, PMA được bổ sung vào với các nồng độ khác nhau (2-10 µM). Cường độ huỳnh quang được đo ngay sau khi PMA được bổ sung. Kết quả cho thấy PMA có tác động làm tăng nồng độ Ca2+ nội bào, tuy nhiên tác động này không rõ ràng và nhanh chóng như A23187 và LPA. Tuy nhiên, PMA không gây ra hiện tượng tan vỡ tế bào như LPA ngay cả ở nồng độ tương đối cao (10 µM) (Hình 3.9).
Thời gian cảm ứng để tăng Ca2+ nội bào diễn ra chậm, đồng thời cường độ huỳnh quang của các tế bào khi sử dụng PMA thấp hơn đáng kể so với cường độ huỳnh quang đo được khi tiến hành thí nghiệm với A23187 và LPA
(Hình 3.10). Sự khác nhau này là do cơ chế tác động của PMA. PMA không kích hoạt kênh vận chuyển Ca2+ mà chỉ kích hoạt protein kinase C. PMA không trực tiếp tham gia vào con đường vận chuyển Ca2+ từ bên ngoài vào tế bào mà chỉ có tác động gián tiếp thông qua kích hoạt protein kinase C dẫn đến hoạt hóa các protein khác. Hàm lượng Ca2+ nội bào khi xử lý tế bào bằng PMA 6 µM được trình bày trong Hình 3.11
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 32
Hình 3.9.Ảnh hưởng của LPA tới nồng độ Ca2+ nội bào
Bên trái: Trước khi bổ sung PMA Bên phải: Sau khi bổ sung PMA 6 µM 10 phút.
Hình 3.10 Biến động của Ca2+ nội bào bởi PMA
Mỗi đường thể hiện sự dao động của nồng độ Ca2+ nội bào của mỗi tế bào đơn. Thí nghiệm được đo liên tục trong 20 phút
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 33
Hình 3.11 Ảnh hưởng của PMA tới nồng độ Ca2+ nội bào
3.6. Xác định ảnh hưởng của Ca2+ nội bào đến sự hình thành vi thể 3.6.1. Ảnh hưởng của A23187 và Ca2+ nội bào đến sự hình thành vi thể 3.6.1. Ảnh hưởng của A23187 và Ca2+ nội bào đến sự hình thành vi thể
Sự hình thành của vi thể đi kèm với sự phá vỡ phân bố bất đối xứng của thành phần lipid màng. Phosphatidyl serine (PS) vốn phân bố ở lớp màng trong sẽ được chuyển ra lớp màng ngoài bởi hoạt động của phospholipid scramblase. Khi cảm ứng tế bào bằng A23187, quá trình hình thành vi thểđược quan sát bằng huỳnh quang của protein Annexin V-FITC gắn đặc hiệu với PS trên bề mặt của tế bào và của vi thể. Sau khi đưa vào các điều kiện cảm ứng khác nhau bao gồm Ca2+ 2 mM khi có mặt A23187 ở nồng độ 2 µM. Ảnh hưởng của thời gian cảm ứng được khảo sát sau các khoảng thời gian khác nhau từ 30, 60, 90, 120 và 240 phút. Sau mỗi khoảng thời gian cảm ứng, tế bào được ủ với Anexin V-FITC trong dung dịch đệm Annexin binding buffer. Kết quả quan sát thấy vi thể bắt đầu hình thành sau 30 phút, sau đó lượng vi thể xuất hiện nhiều hơn và nhiều nhất sau 3 giờ sau thời điểm bắt
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 34 đầu cảm ứng. Việc phát hiện sự hình thành vi thể trên bề mặt màng tế bào bởi Annexin V-FITC được thể hiện trong Hình 3.12.
Hình 3.12. Cảm ứng hình thành vi thể bởi A23187 và Ca2+
Mũi tên đỏ chỉ các vi thể hình thành từ tế bào hồng cầu. Hình ảnh được chụp sau 60 phút cảm ứng tế bào hồng cầu bằng A23187 2 µM và Ca2+ 2 mM
3.6.2. Ảnh hưởng của LPA và Ca2+ nội bào đến sự hình thành vi thể
Để xác định ảnh hưởng của LPA tới sự hình thành vi thể từ tế bào hồng cầu, chúng tôi cũng đã tiến hành thí nghiệm với tế bào hồng cầu được nhuộm Anexin V- FITC. Với các tế bào hồng cầu trong dung dịch sinh lý với nồng độ Ca2+ 2mM, sau khi bổ sung LPA có nồng độ trong dung dịch là 2,5 µM là 5 phút đã có sự hình thành vi thể từ 1 số tế bào hồng cầu. Sau 15 phút, cường độ huỳnh quang từ các tế bào là cực đại, số lượng tế bào hồng cầu hình thành vi thể tăng nhiều (Hình 3.13).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 35
Hình 3.13. Cảm ứng hình thành vi thể bởi LPA và Ca2+
Mũi tên đỏ chỉ các vi thể hình thành từ tế bào hồng cầu. Hình ảnh được chụp sau 15 phút cảm ứng tế bào hồng cầu bằng LPA 2,5 µM và Ca2+ 2 mM
3.6.3. Ảnh hưởng PMA và Ca2+ nội bào đến sự hình thành vi thể
Tương tự,ảnh hưởng Ca2+ nội bào đến sự hình thành vi thể bởi PMA cũng được xác định. Trong thí nghiệm này, nồng độ PMA sử dụng là 6 µM. Tế bào hồng cầu sau khi được cảm ứng bởi PMA trong các khoảng thời gian khác nhau cũng được ủ với Anexin V-FITC. Kết quả cho thấy, khi cảm ứng bằng PMA, sự hình thành và giải phóng vi thể diễn ra chậm hơn. Sau 60 phút cảm ứng vi thể bắt đầu xuất hiện trên bề mặt màng tế bào nhưng số lượng thấp hơn nhiều so với cảm ứng bằng A23187 và LPA (Hình 3.14). Sự khác nhau này là do cơ chế tác động của PMA tới nồng độ Ca2+ nội bào. PMA không kích hoạt kênh vận chuyển Ca2+ mà chỉ kích hoạt protein kinase C. PMA không trực tiếp tham gia vào con đường vận chuyển Ca2+ từ bên ngoài vào tế bào mà chỉ có tác động gián tiếp thông qua kích hoạt protein kinase C dẫn đến hoạt hóa các protein khác.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 36
Hình 3.14. Cảm ứng hình thành vi thể bởi PMA và Ca2+
Mũi tên đỏ chỉ các vi thể hình thành từ tế bào hồng cầu. Hình ảnh được chụp sau 60 phút cảm ứng tế bào hồng cầu bằng PMA 6 µM và Ca2+ 2 mM.
3.7. Nghiên cứu phương pháp thu nhận vi thể
Tế bào hồng cầu được cảm ứng hình thành vi thể trong dung dịch đệm sinh lý có nồng độ Ca2+ 2 mM khi có mặt chất cảm ứng A23187 2 µM hoặc LPA 2,5 µM hoặc PMA 6 µM. Sau 2 giờ mẫu được ly tâm 3 lần ở tốc độ 3000 g trong 1 giờ ở 4ºC để loại bỏ tế bào và các thể apoptosis. Sau đó vi thểđược thu nhận bằng siêu ly tâm 50.000 g trong 1 giờ ở 4ºC. Vi thể thu được sau đó được gửi đi phân tích kích thước bằng máy Zetasizer Nano ZS. Dựa vào kết quả phân tích, chúng tôi đã xây dựng phương pháp thu nhận vi thể từ tế bào hồng cầu (Hình 3.15).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 37
Hình 3.15. Phương pháp thu nhận vi thể từ tế bào hồng cầu 3.8. Xác định kích thước của vi thể
Hiện nay việc xác định kích thước các cấu trúc nano bằng các thiết bị thông thường rất khó khăn. Do vi thể rất nhỏ có kích thước trong phạm vi 0,1 đến 1 µM nên chỉ có thể sử dụng các máy chuyên dụng như kính hiển vi điện tử SEM, AFM. Trong nghiên cứu này, các mẫu vi thểđược gửi phân tích bằng máy Zetasizer Nano ZS (Đại học Aston, Vương quốc Anh).
Kết quả phân tích cho thấy kích thước vi thể thu được có sự khác nhau. Kích thước trung bình của các vi thể thu được dao động trong khoảng từ 150 đến 500 nm tùy thuộc vào điều kiện cảm ứng và thời gian cảm ứng (Bảng 1).
Bảng 1. Kích thước vi thể Chất cảm ứng Phạm vi kích thước vi