a) Xây dựng thang chuẩn
-Cho vào giếng (plate) 900 µl dung dịch đệm sinh lý, 100µl mẫu tế bào đã được ủ với Fluo-4, AM (mật độ tế bào 3.104/ml). Mẫu được để yên trên kính hiển vi huỳnh quang trong 5 phút để các tế bào lắng hết xuống đáy giếng. Một dãy các mẫu được chuẩn bị sẵn, mỗi mẫu được bổ sung Ca2+ để nồng độ Ca2+ ngoại bào là 0 (đối chứng) 0,05; 0,1, 0,5; 1; 5; 50, 100, 1000 và 2000 µM.
-Cho vào mỗi mẫu 5 µl dung dịch A23187 (nồng độ cuối cùng10 µM), để yên trong 10 phút. Trong thời gian này nồng độ Ca2+ nội bào bên ngoài và bên trong tế bào sẽ được cân bằng (mặc dù có hoạt động của bơm Ca2+). Sau đó cường độ huỳnh quang fluo-4 bên trong tế bào của mỗi mẫu sẽ được phân tích bằng kính hiển vi huỳnh quang Nikon SE, sử dụng ánh sáng kích thích 488nm trong thời gian 500 ms. Tương ứng với mỗi nồng độ Ca2+ nội bào, cường độ huỳnh quang của Fluo-4 sẽ khác nhau. Dựa vào thang chuẩn này có thể xác định được hàm lượng Ca2+ nội bào trong các điều kiện thí nghiệm khác nhau khi sử dụng LPA và PMA.
b) Xác định hàm lượng Ca2+ nội bào khi có mặt chất cảm ứng
Tương tự như ở trên, cho vào giếng 900 µl dung dịch đệm sinh lý, 100 µl mẫu tế bào đã được ủ với Fluo-4, AM (mật độ tế bào 3.104/ml). Mẫu được để yên trên kính hiển vi huỳnh quang trong 5 phút để các tế bào lắng hết xuống đáy giếng. Sau đó bổ sung 2µl CaCl2 1M (nồng độ Ca2+ ngoại bào 2 mM).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 22 Trước khi thí nghiệm bắt đầu, bổ sung A23187, LPA hoặc PMA để đạt nồng độ 2; 2,5 và 6 µM tương ứng. Mẫu được phân tích trên kính hiển vi huỳnh quang sử dụng ánh sáng kích thích có bước sóng 488 nm. Nồng độ Ca2+ nội bào được xác định bằng cách so sánh cường độ huỳnh quang tương đối của Fluo-4 với thang chuẩn. Sự biến đổi nồng độ Ca2+ nội bào sẽ được xác định thông qua cường độ huỳnh quang của Fluo-4. Các mẫu được đo liên tục cách nhau 1 phút, hình ảnh được chụp dưới ánh sáng thường và huỳnh quang.