CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN cửu VÀ THẢO LUẬN
3.5.Kết quả thử hoạt tính cellulose của vi khuẩn Acetobacter nhóm 2
Từ 20 mâu vi khuân phân lập được, tuyến chọn sơ bộ được 9 mâu vỉ khuân thuộc chi (giông) Acetobacter, họ Acetobactenaceae là: A], A2, A3, Aỹ, As, A]3, AI5, A]8, A]Ọ.
3.2. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng lên men kombucha
3.2.1. Xác định hàm lượng acid tống số được tạo ra của mỗi chủng vi khuân Acetobacter đã tuyên chọn
Trong quá trình lên men kombucha không chỉ có sản phẩm acid acetic do vi khuấn Acetobacter tạo ra mà còn có nhiều sản phấm acid khác. Vì vậy khi nghiên cúu quá trình lên men kombucha tôi xác định hàm lượng acid tống số tạo ra.
Sau khi tuyển chọn sơ bộ được 9 mẫu vi khuấn Acetobacter chúng tôi tiến hành nuôi cấy 9 chủng này trên môi trường 3, ở nhiệt độ 30()c sau 7 ngày lên men. Chuấn độ xác định hàm lượng acid tống số tạo thành, lặp lại 3 lần một mẫu, kết quả thu được ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Hàm lượng acid tống số sinh ra trong quá trình lên men kombucha từ 9 chủng vi khuân Acetocbacter
Qua bảng 3.1 nhận thấy 9 mẫu vi khuấn Acetobacter thí nghiệm đều có khả năng oxy hóa ethanol tạo thành acid acetic. Hàm lưọng acid tống số có trong dịch lên men từ 25,01 đến 33,00 (g/1). Các mẫu vi khuấn khác nhau tạo ra hàm lượng acid acetic khác nhau, trong đó thấp nhất là mẫu vi khuấn A8, cao nhất là mẫu A15. Vói mục đích tuyển chọn các chủng vi khuấn lên men kombucha có chất lượng tốt, tôi tiến hành đánh giá chất lượng sản phấm thu được từ 9 chủng vi khuấn trên bằng phương pháp cảm quan.
3.2.2. Đánh giá cảm quan sản phẩm kombucha
Sau 7 ngày lên men chúng tôi tiến hành đánh giá chất lượng sản phấm kombucha tạo ra tù’ 9 chủng vi khuấn Acetobacter đã tuyến chọn được bằng phương pháp cảm quan dựa trên các tiêu chí đưa ra ở bảng 2.1, 2.2, 2.3
(phươngpháp 2.2.3) kết quả thu được như sau:
Bảng 3. 2. Khả năng tạo độ trong, hương thơm và mùi vị đặc trưng của kombucha từ 9 chủng vi khuân Acetobacter
Kêt quả cho thây đa sô mẫu vi khuẩn Acetobacter đêu cho chât lượng kombucha có màu vàng tươi, mùi vị đặc trưng tùy theo các mức độ khác nhau. Có thế phân chia các mẫu thành 3 loại sau:
Loại ỉ: Sản phẩm có chất lượng tốt, mùi vị đặc trưng, màu vàng tươi,
hương thơm mát dịu gồm các chủng: A2, A15.
Loại 2: Sản phấm có chất lượng khá và trung bình, có mùi đặc trưng thì
vị chua gắt, có vị đặc trưng thì lại không có mùi thơm, màu sắc tương đối, gồm các chủng: Ai, A6, A13, A18, A19.
Loại 3: Sản phấm có chất lượng kém, không có mùi vị đặc trung, màu
vàng sẫm, gồm các chủng: A3, Ag.
Từ kết quả ở bảng 3.1 kết họp với bảng 3.2 nhận thấy 2 chủng vi khuẩn
Acetobacter A2 và Ai5 có khả năng sinh acid cao và chất lượng sản phấm
kombucha tạo ra thơm, ngon, đặc trưng nên tôi quyết định tuyển chọn 2 chủng này làm đối tượng nghiên cứu tiếp theo.
Kết quả đã phân lập được 20 mãu vi khuân lên men kombucha từ trà Thái Nguyên, tuyên chọn sơ bộ được 9 chủng vỉ khuân Acetobacter. Các chủng vi khuân đã tuyên chọn được dùng đê lên men kombucha tạo ra hàm lượng acỉd và tạo ra sản phârn có chất lượng khác nhau. Trong so các chủng vi khuân đã tuyên chọn được có 2 chủng vỉ khuân Acetobacter A2 và A /5 tạo
s T T
Đặc điểm
Hiện tượng Kết quả
Ai, A3, As, A13, Al8 A2, AJ9 1
Oxy hoá ethanol thành acid acetic
Chuyển hoá môi trường chứa Brom phenol Blue 0,04% từ màu xanh sang màu vàng
+ + +
2 Hoạt tính catalase Hiện tượng sủi bọt khí + + +
3 Sinh trưởng trên (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
môi trường
Sinh khôi không phát
triên - + -
4
Chuyển hoá
glucose thành acid
Vòng sáng xuất hiện xung quanh khuân lạc trên môi trường chứa CaC03
+ + + 5 Kiểm tra khả năng Không hình thành sắc tố nâu — - - 6 Kiêm tra khả năng
Váng vi khuân xuất hiện màu lam + - - 7 Chuyển hoá glycerol thành dihydroxyacetone
Tạo kết tủa đỏ gạch trong dịch sau lên men
+ + +
8
Nhuộm Gram Bắt màu hồng Gra
m âm Gra m âm Gra m âm 42
ra hàm lượng acỉd cao nhất, lên men tạo sản phâm kombucha thom, ngon, đặc trưng.
3.2.3. Phân loại các chủng vi khuẩn đã tuyển chọn đễ lên men kombucha
Đe tiến hành phân loại các chủng vi khuấn đã tuyến chọn chúng tôi cần tiến hành nghiên cứu một số đặc tính sinh học của các chủng vi khuấn đó.
3.2.3.1. Hình thái và tế bào học
Đe quan sát hình dạng tế bào 9 chủng vi khuấn Acetobacter chúng tôi
tiến hành làm tiêu bản nhuộm Gram với dịch nuôi cấy của vi khuấn trên, sau đó soi trên kính hiền vi Olympus CX31 với độ phóng đại 1000 lần. Ket quả cho thấy 9 mẫu Acetobacter đều là Gram âm, có dạng hình que ngắn, hình elip đầu tròn đều với kích thước trung bình 1,5 - 2,5 pm, tế bào xếp dạng đơn, đôi, hoặc chuỗi ngắn.
Acetobacter A2 Acetobacter A /5
Hình 3.6. Hình thái tế bào vi khuấn Acetobacter A2 và AI5 trên kính hiến quang họcịxiooo lần)
3.2.3.2. Sinh trưởng trên môi trường thạch đìa
Vi khuấn Acetobacter khi nuôi cấy trên môi trường đặc sau 3 ngày sẽ hình thành các khuấn lạc đặc trưng, khuấn lạc của vi khuấn có dạng tròn, màu trắng đục, đa số bề mặt khuấn lạc trơn bóng, cấu trúc khuấn lạc đồng nhất, kích thước trung bình của khuấn lạc 1 - 2 mm.
43
Acetobacter Ả2 Acetobacter A]5
Hình 3.7. Khuẩn lạc của vi khuấn Acetobacter A2và Ảj5 trên môi trường thạch đĩa
Acetobacter A2 Acetobacter A Ị5
Hình 3.8. Mau vi khuấn Acetobacter A2 và A /5 trên
môi trường thạch nghiêng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.23.3. Đặc tỉnh sinh hóa
Các đặc tính sinh hóa của 9 chủngvi khuấn Acetobacter được trình bày ở bảng dưới đây:
Bảng 3.3. Đặc điêm sinh hóa của 9 chủng vi khuân Acetobacter
12 16,9+1,295 2,24 18,4+0,530 0,92 24 48,6+0,682 1,18 51,2+2,890 5,00 36 73,5+0,578 1,00 86,5+1,873 3,24 48 115,1+2,514 4,35 128,2+1,821 3,15 60 125,7+2,405 4,16 132,1+4,219 7,30 72 127,3+0,017 0,03 130,8+2,514 4,35 84 103,1+0,035 0,06 110,2+1,295 2,24 96 90,5+0,099 0,17 96,5+1,873 3,24 C h ú thích:
+: Ket quả dương tính Ket quả âm tính
Dựa theo các tiêu chuẩn phân loại vi khuấn acetic của Bergeys (1914), Yamada và cs (2000) [51], Boesch và cs (1998) [17], Bergey (1992) [16], căn cứ vào các kết quả khảo sát các một số đặc điểm sinh học của 9 chủng vi khuẩn Acetobacter có thể khẳng định đây là các mẫu vi khuẩn thuộc họ
Acetobacteraceae.
Trong khóa phân loại của Bergeys (1914) đã phân chia các loài trong giống Acetobacter thành 2 nhóm:
Nhóm 1: sử dụng muối amoni làm nguồn nitơ duy nhất( dung dịch Hoyer)
gồm các chủng: Ag, A13, A]8
Nhóm 2: không sử dụng muối amoni làm nguồn nitơ duy nhất gồm 2
nhóm:
Trên môi trường dịch thế tạo thành màng nhầy dày có chứa cellulose gồm các chủng: Ai, A3, A6, A15.
Trên môi trường dịch thế không tạo thành màng nhầy có chứa cellulose gồm các chủng: A2, AỊ9.
Vậy dựa vào đặc điếm hình thái và đặc tính sinh hóa của 9 chủng vi khuẩn đã tuyển chọn, theo Bergeys (1914), Nguyễn Lân Dũng (1976) [8] tạm xếp 9 chủng Acetobacter vầo 3 chủng sau: Acetobacter xylỉnus (gồm các chủng vi khuấn Ai. A3, A6, A]5), Acetobacter aceti (gồm các chủng vi khuấn Ag, AỊ3, A]8),
Acetobacter pasteurianus (gồm các chủng A2, A]9).
Năm 1950, Frateur đã chính thức đưa ra khóa phân loại mới căn cứ vào các tiêu chuẩn như: khả năng oxy hoá acid acetic thành C02 và H20; hoạt tính catalase; khả năng sinh trưởng trên môi trường Hoyer [23]... Theo quan điếm này A. xylỉnus, A. aceti, A. pasteurianus là chủng vi khuẩn thuộc chi
Acetobacter, họ Pseucỉomonadaceae, bộ Pseudomonadales, lóp
Schiiomycetes. Ket quả này phù họp với Balentine DA (1997) [15] phân lập
được Acetobacter xylỉnus, Liu CH, Hsu WH, Lee FL, Liao cc (1996) [38] phân lập được Acetobacter aceti, Acetobacter pasteurianus trong kombucha.
Như vậy, từ 20 mâu vi khuân ban đâu phân lập được đã tuyên chọn sơ bộ được 9 chủng vỉ khuân Acetobacter xép vào 3 chủng A. xylỉnus, A. aceti,A. pasteurỉanus.
Trong quá trình lên men kombucha chúng tôi đã tiến hành đánh giá cảm quan các sản phấm được lên men từ 9 mẫu vi khuấn Acetobacter( bảng 3.2), trong số các sản phấm đó nhận thấy có 2 sản phấm tạo ra từ chủng
Acetobacter A2 và Acetobacter A15 có mùi vị thơm, ngon, đặc trưng phù hợp
với mục đích nghiên cứu. Chính vì vậy, chúng tôi quyết định dùng 2 chủng vi khuấn này sử dụng đế nghiên cứu trong suốt đề tài.
3.2.4. Nghiên cứu động thái sinh trưởng của chủng vi khuẩn Acetobacter Ả2 và AỊ5
Động thái sinh trưởng của một chủng vi khuấn phản ánh khả năng sinh trưởng và sinh sản của chúng trong thời gian nhất định. Tùy vào hình thức nuôi cấy liên tục (môi trường nuôi cấy vi sinh vật thường xuyên được bổ sung chất dinh dưõng) hay hình thức nuôi cấy không liên tục (môi trường nuôi cấy vi sinh vật không được bố sung chất dinh dưỡng) mà động thái sinh trưởng của chúng là khác nhau. Đê nghiên cứu động thái sinh trưởng của Acetobacter A2 và Ai5 chúng tôi tiến hành nuôi cấy vi khuấn trên môi trường dịch thể, trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, sau những khoảng thời gian định sẵn, dịch nuôi cấy được lấy ra để xác định số lượng tế bào. Chúng tôi sử dụng phương pháp đếm số lượng tế bào trong dịch nuôi cấy ở các thời điểm: 0, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96 giờ bằng cách đếm số lượng tế bào trên buồng đếm. Ket quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 3.4 và hình 3.9
Bảng 3.4. Quá trình sinh trưởng của chủng Acetobacter A2và
47
Hình 3.9. Đồ thị hiếu diễn động thái sinh trưởng của chủng Acetobacter A2 và A15
Từ kết quả nghiên cúu ở bảng 3.4 và hình 3.9 ta thấy: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Trong 12 giờ đầu pha lag, số luợng tế bào trong dịch nuôi cấy tăng đều nhưng mức tăng chậm. Giai đoạn này vi khuấn làm quen với môi trường, tích luỹ chất dinh dưỡng và năng lượng cho các giai đoạn sinh trưởng tiếp theo.
Từ 12 - 48 giờ: Pha cấp số mũ (pha log), ở pha này số lượng tế bào tăng nhanh và đạt giá trị cực đại ở 48 giờ. Từ 24 giờ trở đi trong dịch nuôi cấy bắt đầu xuất hiện những sợi cellulose lo lửng.
Từ 48 - 72 giờ: Pha cân bằng động, ở pha này số lượng tế bào trong dịch nuôi cấy ốn định; số lượng tế bào chết đi và số lượng tế bào sinh ra tương đối bằng nhau. Các sợi cellulose liên kết với nhau tạo thành lóp màng mong trên bề mặt môi trường dịch thế dần dần dày dần lên theo thời gian.
Từ 72 giờ trở đi: Pha suy vong, ở pha này số lượng tế bào chết đi nhiều số lượng tế bào sinh ra làm cho tống tế bào trong dịch nuôi cấy giảm nhanh, hon giảm nhanh chóng do nguồn dinh dưõng cạn kiệt, sản phấm độc sản sinh trong quá trình trao đối chất tăng. Trong quá trình sinh trưởng, Acetobacter A2 và ẢJ5 CÓ thề tích luỹ được lượng acid acetic nhất định trong dịch lên men
làm cho giá trị pH môi trường giảm dần theo thời gian [3]. Ket quả trên phù hợp với nghiên cứu của Bergey [16], Đinh Thị Kim Nhung (1996) [2] với số lượng tế bào vi khuấn đạt cực đại tại 48 giờ.
3.3. Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố tói quá trình lên menkombucha kombucha
3.3.1. Khảo sát ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến quá trình lênmen kombucha men kombucha
3.3.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của (NH2)2S04
Nguồn nitơ cung cấp cho cơ thế vi sinh vật nguyên liệu đế hình thành các nhóm amin trong các phân tử aminoacid, nucleotit, các bazơ dị vòng và các hợp chất hóa học trong nguyên sinh chất giúp cho vi sinh vật sinh trưởng và phát triển. Nguồn nitơ dễ hấp thụ nhất đối với vi sinh vật là NH3 và NH4+. Do đó tôi quyết định chọn nguồn nitơ là (NH4)2S04 và thay đối nồng độ từ 1 đến 3 g/1. Kết quả thu được thể hiện qua biểu đồ sau:
Hình 3.10. Biếu đồ hiểu diễn ảnh hưởng của (NH4)2S04 đến hàm lượng acid tống số sinh ra của 2 chủng Acetobacter A2 và A15
Từ biểu đồ ta nhận thấy hàm lượng acid tạo thành từ 2 chủng
Acetobacter A2 và Acetobacter A]5 đạt cực đại khi hàm lượng (NH4)2S04 bố
sung ở mức 2 g/1. Hàm lượng (NH4)2S04 bố sung cao quá hoặc thấp quá đều ảnh hưởng đến hàm lượng acid tạo thành. Nguyên nhân này được giải thích như sau: mỗi loài vi sinh vật đều có khả năng hấp thụ nhất định các chất dinh dưỡng khác nhau là khác nhau. (NH4)2SƠ4 cung cấp nguồn nitơ cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của tế bào vi khuẩn Acetobacter . Khi hàm lượng
<0 c 33,000 <5 1.5 2 2.5 3 Hàm lượng
49
(NH4)2S04 bổ sung quá cao vi khuẩn sẽ không thể hấp thụ hết, luợng (NH4)2S04 dư trong môi trường sẽ ức chế sự phát triển của tế bào vi khuấn cũng như đối với nấm men cùng sống cộng sinh trong kombucha. Neu hàm lượng (NH4)2S04 bố sung quá thấp sẽ không đủ cung cấp cho nhu cầu của vi khuấn, do vậy lượng acid tạo ra thấp. Mặt khác nitơ còn có mặt trong thành phần cấu tạo của nhiều hợp chất quan trọng như: acid nucleic, photphoslipid, một số coenzyme quan trọng như ATP, ADP, NADP, FAD và một số vitamin tham gia vào quá trình oxy hóa ethanol thành acid acetic.
Nhu vậy, hàm lượng (NH4)2S04 thích hợp bô sung cho quá trình lên men kombucha là 2 g/l.
3.3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của MgSỠ4.7H20
Chúng ta cần phải cung cấp một lưọng magie khá cao cho vi sinh vật. Magie mang tính chất của một cofactor, chúng tham gia vào nhiều phản ứng enzyme có liên quan đến quá trình phosphoryl hóa. Ngoài ra magie giữ vai trò quan trọng trong việc làm liên kết các tiểu phần ribosome với nhau [6]. Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của MgS04. 7H20 đến quá trình lên men kombucha ở các nồng độ khác nhau, kết quả được thể hiện qua biểu đồ sau:
□ Acetobacte r A2 0.5 1 1.5 2 2.5 Hàm lượng MgS04.7H20
Hình 3.11. Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của MgS04. 7H20 đến hàm lượng acid tống số sinh ra của 2 chủng Acetobacter Ả2 và A 75
Qua biểu đồ ta thấy hàm lượng MgS04. 7H20 bố sung cho quá trình lên men ảnh hưởng tới hàm lưọng acid tống số sinh ra. Mg là một nhân
tố tham gia tạo thành enzyme có liên quan đến quá trình phosphoryl hóa. Hàm lượng MgS04.7H20 quá thấp sẽ không đủ cung cấp cho hoạt động của tế bào vi khuấn, nếu hàm lượng quá cao sẽ ức chế quá trình tạo ra acid.
Như vậy, hàm lượng MgS04. 7H20 cần bô sung cho quả trình lên men kombucha là ĩ,5 g/l.
33.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của KH2PO4
Phospho(P) và các hợp chất chứa phospho cũng như nồng độ của chúng trong môi trường có ảnh hưởng rất lớn đến quá trình trao đối chất của tế bào vi sinh vật. Khi thay đối nồng độ các hợp chất phospho trong môi trường sẽ dẫn đến thay đối hàng loạt các quá trình tống họp các chất họp phần của tế bào có chứa phospho, tế bào chất và nhân. Ngoài ra, phospho trong môi trường có tác dụng điều chỉnh hoạt tính enzyme đồng hóa thức ăn cacbon.
Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của KH2PO4 đến quá trình lên men kombucha ở các nồng độ khác nhau, kết quả thu được như sau:
□
Acetobact
er A2 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
0.5 1 1.5 2 2.5
Hàm lượng KH2P04 (g/i)
Hình 3.12. Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của KH2PO4 đến hàm lượng acid tons số sinh ra của2 chủng Acetobacter Ả2và A/5
KH2PO4 1,0 (g/1) KH2P04 1,5 (g/1)
Hình 3.13. Anh kombucha lên men từ chủng
Chủng Ngày M+m (g/1) õ (%) Cv(% ) A2 0 0,000+0,000 0,000 0,000 1 4,310+0,006 0,010 2,320 2 9,380+0,023 0,040 4,264 3 15,610+0,010 0,017 1,089 4 23,250+0,035 0,061 2,624 5 29,810+0,004 0,007 0,235 6 31,320+0,017 0,030 0,958 7 32,450+0,053 0,092 2,835 8 32,890+0,099 0,171 5,199 9 33,150+0,035 0,061 1,840 A,5 0 0,000+0,000 0,000 0,000 1 5,120+0,017 0,030 5,859 2 9,950+0,035 0,061 6,131 3 16,720+0,023 0,040 2,392 4 22,190+0,039 0,069 3,110 5 28,920+0,034 0,059 2,040 6 31,290+0,027 0,046 1,470 7 32,820+0,012 0,020 0,609 8 33,010+0,053 0,092 2,787 9 33,190+0,021 0,036 1,085 51
Qua biểu đồ trên cho thấy, ở hàm lượng 1,0 g/1 môi trường cho hiệu suất lên men cao nhất.
Có nhiều nguyên nhân dẫn đến ảnh hưởng của hàm lượng acid sinh ra nhưng chủ yếu là do phospho và kali có nhiều trong thành phần cấu tạo quan trọng của tế bào vi khuấn như: acid nucleic, protein, phospholipid và nhiều coenzyme quan trọng như ADP, ATP, NADP,... tham gia vào quá trình oxy hóa rượu thành acid acetic đến cơ2 và H2Ơ. Khi hàm lượng KH2P04 từ 2,5 g/1 trở lên sẽ dẫn tới dư thừa nó làm thay đối đặc tính lý hóa của môi trường,