CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN cửu VÀ THẢO LUẬN
3.2.3.1. Hình thái và tế bào học
Đe quan sát hình dạng tế bào 9 chủng vi khuấn Acetobacter chúng tôi
tiến hành làm tiêu bản nhuộm Gram với dịch nuôi cấy của vi khuấn trên, sau đó soi trên kính hiền vi Olympus CX31 với độ phóng đại 1000 lần. Ket quả cho thấy 9 mẫu Acetobacter đều là Gram âm, có dạng hình que ngắn, hình elip đầu tròn đều với kích thước trung bình 1,5 - 2,5 pm, tế bào xếp dạng đơn, đôi, hoặc chuỗi ngắn.
Acetobacter A2 Acetobacter A /5
Hình 3.6. Hình thái tế bào vi khuấn Acetobacter A2 và AI5 trên kính hiến quang họcịxiooo lần)
3.2.3.2. Sinh trưởng trên môi trường thạch đìa
Vi khuấn Acetobacter khi nuôi cấy trên môi trường đặc sau 3 ngày sẽ hình thành các khuấn lạc đặc trưng, khuấn lạc của vi khuấn có dạng tròn, màu trắng đục, đa số bề mặt khuấn lạc trơn bóng, cấu trúc khuấn lạc đồng nhất, kích thước trung bình của khuấn lạc 1 - 2 mm.
43
Acetobacter Ả2 Acetobacter A]5
Hình 3.7. Khuẩn lạc của vi khuấn Acetobacter A2và Ảj5 trên môi trường thạch đĩa
Acetobacter A2 Acetobacter A Ị5
Hình 3.8. Mau vi khuấn Acetobacter A2 và A /5 trên
môi trường thạch nghiêng
3.23.3. Đặc tỉnh sinh hóa
Các đặc tính sinh hóa của 9 chủngvi khuấn Acetobacter được trình bày ở bảng dưới đây:
Bảng 3.3. Đặc điêm sinh hóa của 9 chủng vi khuân Acetobacter
12 16,9+1,295 2,24 18,4+0,530 0,92 24 48,6+0,682 1,18 51,2+2,890 5,00 36 73,5+0,578 1,00 86,5+1,873 3,24 48 115,1+2,514 4,35 128,2+1,821 3,15 60 125,7+2,405 4,16 132,1+4,219 7,30 72 127,3+0,017 0,03 130,8+2,514 4,35 84 103,1+0,035 0,06 110,2+1,295 2,24 96 90,5+0,099 0,17 96,5+1,873 3,24 C h ú thích:
+: Ket quả dương tính Ket quả âm tính
Dựa theo các tiêu chuẩn phân loại vi khuấn acetic của Bergeys (1914), Yamada và cs (2000) [51], Boesch và cs (1998) [17], Bergey (1992) [16], căn cứ vào các kết quả khảo sát các một số đặc điểm sinh học của 9 chủng vi khuẩn Acetobacter có thể khẳng định đây là các mẫu vi khuẩn thuộc họ
Acetobacteraceae.
Trong khóa phân loại của Bergeys (1914) đã phân chia các loài trong giống Acetobacter thành 2 nhóm:
Nhóm 1: sử dụng muối amoni làm nguồn nitơ duy nhất( dung dịch Hoyer)
gồm các chủng: Ag, A13, A]8
Nhóm 2: không sử dụng muối amoni làm nguồn nitơ duy nhất gồm 2
nhóm:
Trên môi trường dịch thế tạo thành màng nhầy dày có chứa cellulose gồm các chủng: Ai, A3, A6, A15.
Trên môi trường dịch thế không tạo thành màng nhầy có chứa cellulose gồm các chủng: A2, AỊ9.
Vậy dựa vào đặc điếm hình thái và đặc tính sinh hóa của 9 chủng vi khuẩn đã tuyển chọn, theo Bergeys (1914), Nguyễn Lân Dũng (1976) [8] tạm xếp 9 chủng Acetobacter vầo 3 chủng sau: Acetobacter xylỉnus (gồm các chủng vi khuấn Ai. A3, A6, A]5), Acetobacter aceti (gồm các chủng vi khuấn Ag, AỊ3, A]8),
Acetobacter pasteurianus (gồm các chủng A2, A]9).
Năm 1950, Frateur đã chính thức đưa ra khóa phân loại mới căn cứ vào các tiêu chuẩn như: khả năng oxy hoá acid acetic thành C02 và H20; hoạt tính catalase; khả năng sinh trưởng trên môi trường Hoyer [23]... Theo quan điếm này A. xylỉnus, A. aceti, A. pasteurianus là chủng vi khuẩn thuộc chi
Acetobacter, họ Pseucỉomonadaceae, bộ Pseudomonadales, lóp
Schiiomycetes. Ket quả này phù họp với Balentine DA (1997) [15] phân lập
được Acetobacter xylỉnus, Liu CH, Hsu WH, Lee FL, Liao cc (1996) [38] phân lập được Acetobacter aceti, Acetobacter pasteurianus trong kombucha.
Như vậy, từ 20 mâu vi khuân ban đâu phân lập được đã tuyên chọn sơ bộ được 9 chủng vỉ khuân Acetobacter xép vào 3 chủng A. xylỉnus, A. aceti,A. pasteurỉanus.
Trong quá trình lên men kombucha chúng tôi đã tiến hành đánh giá cảm quan các sản phấm được lên men từ 9 mẫu vi khuấn Acetobacter( bảng 3.2), trong số các sản phấm đó nhận thấy có 2 sản phấm tạo ra từ chủng
Acetobacter A2 và Acetobacter A15 có mùi vị thơm, ngon, đặc trưng phù hợp
với mục đích nghiên cứu. Chính vì vậy, chúng tôi quyết định dùng 2 chủng vi khuấn này sử dụng đế nghiên cứu trong suốt đề tài.
3.2.4. Nghiên cứu động thái sinh trưởng của chủng vi khuẩn Acetobacter Ả2 và AỊ5
Động thái sinh trưởng của một chủng vi khuấn phản ánh khả năng sinh trưởng và sinh sản của chúng trong thời gian nhất định. Tùy vào hình thức nuôi cấy liên tục (môi trường nuôi cấy vi sinh vật thường xuyên được bổ sung chất dinh dưõng) hay hình thức nuôi cấy không liên tục (môi trường nuôi cấy vi sinh vật không được bố sung chất dinh dưỡng) mà động thái sinh trưởng của chúng là khác nhau. Đê nghiên cứu động thái sinh trưởng của Acetobacter A2 và Ai5 chúng tôi tiến hành nuôi cấy vi khuấn trên môi trường dịch thể, trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, sau những khoảng thời gian định sẵn, dịch nuôi cấy được lấy ra để xác định số lượng tế bào. Chúng tôi sử dụng phương pháp đếm số lượng tế bào trong dịch nuôi cấy ở các thời điểm: 0, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96 giờ bằng cách đếm số lượng tế bào trên buồng đếm. Ket quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 3.4 và hình 3.9
Bảng 3.4. Quá trình sinh trưởng của chủng Acetobacter A2và
47
Hình 3.9. Đồ thị hiếu diễn động thái sinh trưởng của chủng Acetobacter A2 và A15
Từ kết quả nghiên cúu ở bảng 3.4 và hình 3.9 ta thấy:
Trong 12 giờ đầu pha lag, số luợng tế bào trong dịch nuôi cấy tăng đều nhưng mức tăng chậm. Giai đoạn này vi khuấn làm quen với môi trường, tích luỹ chất dinh dưỡng và năng lượng cho các giai đoạn sinh trưởng tiếp theo.
Từ 12 - 48 giờ: Pha cấp số mũ (pha log), ở pha này số lượng tế bào tăng nhanh và đạt giá trị cực đại ở 48 giờ. Từ 24 giờ trở đi trong dịch nuôi cấy bắt đầu xuất hiện những sợi cellulose lo lửng.
Từ 48 - 72 giờ: Pha cân bằng động, ở pha này số lượng tế bào trong dịch nuôi cấy ốn định; số lượng tế bào chết đi và số lượng tế bào sinh ra tương đối bằng nhau. Các sợi cellulose liên kết với nhau tạo thành lóp màng mong trên bề mặt môi trường dịch thế dần dần dày dần lên theo thời gian.
Từ 72 giờ trở đi: Pha suy vong, ở pha này số lượng tế bào chết đi nhiều số lượng tế bào sinh ra làm cho tống tế bào trong dịch nuôi cấy giảm nhanh, hon giảm nhanh chóng do nguồn dinh dưõng cạn kiệt, sản phấm độc sản sinh trong quá trình trao đối chất tăng. Trong quá trình sinh trưởng, Acetobacter A2 và ẢJ5 CÓ thề tích luỹ được lượng acid acetic nhất định trong dịch lên men
làm cho giá trị pH môi trường giảm dần theo thời gian [3]. Ket quả trên phù hợp với nghiên cứu của Bergey [16], Đinh Thị Kim Nhung (1996) [2] với số lượng tế bào vi khuấn đạt cực đại tại 48 giờ.
3.3. Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố tói quá trình lên menkombucha kombucha
3.3.1. Khảo sát ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến quá trình lênmen kombucha men kombucha
3.3.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của (NH2)2S04
Nguồn nitơ cung cấp cho cơ thế vi sinh vật nguyên liệu đế hình thành các nhóm amin trong các phân tử aminoacid, nucleotit, các bazơ dị vòng và các hợp chất hóa học trong nguyên sinh chất giúp cho vi sinh vật sinh trưởng và phát triển. Nguồn nitơ dễ hấp thụ nhất đối với vi sinh vật là NH3 và NH4+. Do đó tôi quyết định chọn nguồn nitơ là (NH4)2S04 và thay đối nồng độ từ 1 đến 3 g/1. Kết quả thu được thể hiện qua biểu đồ sau:
Hình 3.10. Biếu đồ hiểu diễn ảnh hưởng của (NH4)2S04 đến hàm lượng acid tống số sinh ra của 2 chủng Acetobacter A2 và A15
Từ biểu đồ ta nhận thấy hàm lượng acid tạo thành từ 2 chủng
Acetobacter A2 và Acetobacter A]5 đạt cực đại khi hàm lượng (NH4)2S04 bố
sung ở mức 2 g/1. Hàm lượng (NH4)2S04 bố sung cao quá hoặc thấp quá đều ảnh hưởng đến hàm lượng acid tạo thành. Nguyên nhân này được giải thích như sau: mỗi loài vi sinh vật đều có khả năng hấp thụ nhất định các chất dinh dưỡng khác nhau là khác nhau. (NH4)2SƠ4 cung cấp nguồn nitơ cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của tế bào vi khuẩn Acetobacter . Khi hàm lượng
<0 c 33,000 <5 1.5 2 2.5 3 Hàm lượng
49
(NH4)2S04 bổ sung quá cao vi khuẩn sẽ không thể hấp thụ hết, luợng (NH4)2S04 dư trong môi trường sẽ ức chế sự phát triển của tế bào vi khuấn cũng như đối với nấm men cùng sống cộng sinh trong kombucha. Neu hàm lượng (NH4)2S04 bố sung quá thấp sẽ không đủ cung cấp cho nhu cầu của vi khuấn, do vậy lượng acid tạo ra thấp. Mặt khác nitơ còn có mặt trong thành phần cấu tạo của nhiều hợp chất quan trọng như: acid nucleic, photphoslipid, một số coenzyme quan trọng như ATP, ADP, NADP, FAD và một số vitamin tham gia vào quá trình oxy hóa ethanol thành acid acetic.
Nhu vậy, hàm lượng (NH4)2S04 thích hợp bô sung cho quá trình lên men kombucha là 2 g/l.
3.3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của MgSỠ4.7H20
Chúng ta cần phải cung cấp một lưọng magie khá cao cho vi sinh vật. Magie mang tính chất của một cofactor, chúng tham gia vào nhiều phản ứng enzyme có liên quan đến quá trình phosphoryl hóa. Ngoài ra magie giữ vai trò quan trọng trong việc làm liên kết các tiểu phần ribosome với nhau [6]. Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của MgS04. 7H20 đến quá trình lên men kombucha ở các nồng độ khác nhau, kết quả được thể hiện qua biểu đồ sau:
□ Acetobacte r A2 0.5 1 1.5 2 2.5 Hàm lượng MgS04.7H20
Hình 3.11. Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của MgS04. 7H20 đến hàm lượng acid tống số sinh ra của 2 chủng Acetobacter Ả2 và A 75
Qua biểu đồ ta thấy hàm lượng MgS04. 7H20 bố sung cho quá trình lên men ảnh hưởng tới hàm lưọng acid tống số sinh ra. Mg là một nhân
tố tham gia tạo thành enzyme có liên quan đến quá trình phosphoryl hóa. Hàm lượng MgS04.7H20 quá thấp sẽ không đủ cung cấp cho hoạt động của tế bào vi khuấn, nếu hàm lượng quá cao sẽ ức chế quá trình tạo ra acid.
Như vậy, hàm lượng MgS04. 7H20 cần bô sung cho quả trình lên men kombucha là ĩ,5 g/l.
33.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của KH2PO4
Phospho(P) và các hợp chất chứa phospho cũng như nồng độ của chúng trong môi trường có ảnh hưởng rất lớn đến quá trình trao đối chất của tế bào vi sinh vật. Khi thay đối nồng độ các hợp chất phospho trong môi trường sẽ dẫn đến thay đối hàng loạt các quá trình tống họp các chất họp phần của tế bào có chứa phospho, tế bào chất và nhân. Ngoài ra, phospho trong môi trường có tác dụng điều chỉnh hoạt tính enzyme đồng hóa thức ăn cacbon.
Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của KH2PO4 đến quá trình lên men kombucha ở các nồng độ khác nhau, kết quả thu được như sau:
□
Acetobact
er A2
0.5 1 1.5 2 2.5
Hàm lượng KH2P04 (g/i)
Hình 3.12. Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của KH2PO4 đến hàm lượng acid tons số sinh ra của2 chủng Acetobacter Ả2và A/5
KH2PO4 1,0 (g/1) KH2P04 1,5 (g/1)
Hình 3.13. Anh kombucha lên men từ chủng
Chủng Ngày M+m (g/1) õ (%) Cv(% ) A2 0 0,000+0,000 0,000 0,000 1 4,310+0,006 0,010 2,320 2 9,380+0,023 0,040 4,264 3 15,610+0,010 0,017 1,089 4 23,250+0,035 0,061 2,624 5 29,810+0,004 0,007 0,235 6 31,320+0,017 0,030 0,958 7 32,450+0,053 0,092 2,835 8 32,890+0,099 0,171 5,199 9 33,150+0,035 0,061 1,840 A,5 0 0,000+0,000 0,000 0,000 1 5,120+0,017 0,030 5,859 2 9,950+0,035 0,061 6,131 3 16,720+0,023 0,040 2,392 4 22,190+0,039 0,069 3,110 5 28,920+0,034 0,059 2,040 6 31,290+0,027 0,046 1,470 7 32,820+0,012 0,020 0,609 8 33,010+0,053 0,092 2,787 9 33,190+0,021 0,036 1,085 51
Qua biểu đồ trên cho thấy, ở hàm lượng 1,0 g/1 môi trường cho hiệu suất lên men cao nhất.
Có nhiều nguyên nhân dẫn đến ảnh hưởng của hàm lượng acid sinh ra nhưng chủ yếu là do phospho và kali có nhiều trong thành phần cấu tạo quan trọng của tế bào vi khuấn như: acid nucleic, protein, phospholipid và nhiều coenzyme quan trọng như ADP, ATP, NADP,... tham gia vào quá trình oxy hóa rượu thành acid acetic đến cơ2 và H2Ơ. Khi hàm lượng KH2P04 từ 2,5 g/1 trở lên sẽ dẫn tới dư thừa nó làm thay đối đặc tính lý hóa của môi trường, ức chế quá trình sinh trưởng và phát triến của vi khuấn dẫn tới ảnh hưởng đến hàm lượng acid acetic sinh ra. Ngược lại nếu lượng phospho kali quá thấp (dưới 0,5 g/1) sẽ ảnh hưởng tới việc cấu thành coezyme xúc tác cho phản ứng trong quá trình sinh trưởng của vi khuẩn. Hàm lượng KH2PƠ4 bổ sung cho quá trình lên men kombucha là 1,5 g/1.
Như vậy, hàm lượng (NH4)2S04, MgS04.7H20, KH2P04 bô sung cho quá trình lên men kombucha lần lượt là 2; 1,5; 1,5 (g/ỉ).
3.3.2. Khảo sát ánh hưởng của điều kiện môi trường tới quá trình lên men kombucha
3.3.2. ỉ. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên men
Khi nuôi cấy Acetobacter A2 và Acetobacter Aì5 trong MT3 đã được thanh trùng ở 110°c trong vòng 20 phút, trong điều kiện nuôi cấy tĩnh ở 30°c, nhận thấy:
Trong ngày đầu, số lượng tế bào trong dịch nuôi cấy tăng nhưng ở mức độ chậm. Vì ở giai đoạn này vi khuấn làm quen với môi trường, tích lũy chất dinh dưỡng và năng lượng cho các giai đoạn tiếp theo. Đồng thời với quá trình tăng trưởng tế bào thì lượng acid cũng bắt đầu hình thành, pH môi trường giảm nhẹ.
52
Từ ngày thứ 2 đến ngày thứ 7 lưọng acid tăng nhanh, giai đoạn này các tế bào sinh trưởng mạnh và biến đối êtylic thành acid acetic. Từ ngày thứ 7 trở đi lượng acid vẫn tiếp tục tăng nhưng với tốc độ chậm. Ket quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên men được thế hiện qua bảng sau:
Bảng 3.5. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên men đến hàm lượng acỉd tống số sinh ra của 2 chủng Acetobacter A2 và AI5
A2 2 4 28,920+0,010 0,017 0,588 6 30,040+0,035 0,061 2,031 8 32,110+0,004 0,007 0,218 10 32,340+0,017 0,030 0,928 12 33,060+0,053 0,092 2,783 Ai5 2 28,710+0,099 0,171 5,956 4 29,570+0,035 0,061 2,063 6 31,250+0,021 0,036 1,152 8 32,360+0,017 0,030 0,927 10 32,980+0,035 0,061 1,850 12 33,110+0,023 0,040 1,209
Từ kết quả dẫn ra ở 3ẩng 3.6, nhận thấy: Tỷ lệ giống bố sung từ 2
Chủng pH M±m (g/1) ô (%) c v ( % ) A 2 3 30,920+0,053 0,092 2,975 3,5 31,800+0,099 0,171 5,377 4 32,890+0,035 0,061 1,855 4,5 32,000+0,000 0,000 0,000 5 31,850+0,017 0,030 0,942 A,5 3 31,230+0,035 0,061 1,953 3,5 31,910+0,023 0,040 1,254 4 32,960+0,039 0,069 2,093 4,5 32,750+0,034 0,059 1,802 5 31,300+0,027 0,046 1,470 Chủng Nhiệt độ(°C) M+m (g/1) ố (%) cv(%) A2 15 13,210+0,035 0,061 3,544 20 27,920+0,004 0,007 0,251 25 32,390+0,017 0,030 0,926 30 33,010+0,053 0,092 2,787 35 31,970+0,099 0,171 5,349 40 22,100+0,035 0,061 5,041 A|5 15 16,450+0,000 0,000 0,000 20 28,100+0,017 0,030 1,068 25 30,570+0,035 0,061 1,873 30 32,990+0,023 0,040 1,212 35 30,510+0,039 0,069 2,186
5 ngày 7 ngày 9 ngày
Hình 3.14. Anh kombucha lên men từ chủng Acetobacter Ả2 với thòi gian lên men 5,7 và 9 ngày
Thời gian lên men càng lâu thì lượng acid sinh ra càng tăng, độ pH càng ngày càng giảm làm cho sản phấm trở nên chua hon. Đe thu được sản phấm kombucha thơm, ngon, có vị chua dịu mát chúng ta nên thu sản phấm ở ngày lên men thứ 7 của quá trình lên men.
33.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng giống bô sung ban đầu
Hàm lượng giống là một trong những yếu tố quyết định đến quá trình lên men, cần có tỷ lệ giống phù họp vói quá trình lên men nhằm đạt hiệu suất lên men cao và cho ra chất lượng sản phẩm kombucha thơm, ngon. Hàm lượng giống bổ sung trước khi lên men là rất quan trọng. Neu bổ sung không đủ giống thì quá trình lên men diễn ra chậm, hơn nữa dịch lên men sẽ dễ nhiễm tạp. Ngược lại, nếu bố sung nhiều giống quá thì hàm lượng dinh dường trong dịch lên men có thế không đáp ứng đủ cho vi khuấn sinh trưởng và tăng sinh khối, xét về mặt kinh tế sẽ làm tăng giá thành sản phấm. Chúng tôi tiến hành cấy 2 chủng vào môi trường dịch lên men với tỷ lệ giống ban đầu là: 2, 4, 6, 8, 10,12%v. Sau 7 ngày lên men chúng tôi tiến hành đo hàm lượng acid sinh ra, kết quả thu được như sau:
Bảng 3.6. Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng giống đến hàm lượng acid
6% là không phù hợp. Ớ tỷ lệ giống này thời gian lên men diễn ra dài hơn, tốc độ lên men diễn ra chậm, dịch lên men dễ bị nhiễm tạp. Tỷ lệ giống bô sung là 8% quá trình lên men tương đối tốt, tuy nhiên chưa thực sự tạo ra được mùi vị đặc trung của kombucha. Ớ tỷ lệ giống bố sung là 10% và 12%, nhận thấy quá trình lên men diễn ra nhanh, sản phấm tạo ra có vị thơm ngon