CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN cửu VÀ THẢO LUẬN
1.8. Trà Thái Nguyên
—*■ phân loại —> sao hương —> phân loại —> sản phẩm.
Trong quá trình sản xuất trà xanh, tùy theo từng phương pháp diệt men khác nhau và phương pháp làm khô khác nhau mà chia ra nhiều loại theo tính chất, hương vị đặc biệt của nó.
1.2.2. Đặc điếm của trà xanh Thái Nguyên
• Ngoại hình: xoăn chặt, màu xanh đen • Màu nước xanh tươi hoặc xanh vàng • Hương: hương thom đặc trưng của trà tươi • Vị: chát đậm, có hậu vị
Hình 1.8. Trà Thái Nguyên
Do quá trình diệt men làm đình chỉ hoạt động của enzyme, nên các thành phần trong trà xanh rất ít bị biến đối, hàm lượng polyphenol trích ly trong nước là 30 - 40%, các vitamin và khoáng chất vẫn được giữ lại (đặc biệt là vitamin C). Vì vậy, giá trị dinh dưỡng của trà xanh tương đối cao. Trà xanh có khả năng chống ung thư cao, tác dụng tương tự như trà tươi.
1.3. Tình hình nghiên cứu về kombucha ỏ’ Việt Nam và trên thế giói
1.3.1. Trên thế giới
Đồ uống chức năng là một phân ngành quan trọng trong phạm vi thực phẩm chức năng. Thị phần của đồ uống chức năng của Mỹ chiếm 48,9% của
một ngàn triệu đô la giá trị ngành công nghiệp không cồn, với tốc độ tăng trưởng hàng năm cao nhất là 15% đến 20% [41]. Thị trường này được dự đoán sẽ có sự gia tăng bởi vì mọi người có chủ động hơn trong công tác phòng chống và kiếm soát bệnh tật, họ tập trung vào các thành phần lành mạnh tự nhiên. Chức năng của đồ uống để cung cấp lợi ích sức khỏe chang hạn như sức khỏe tim mạch, cải thiện khả năng miễn dịch và tiêu hóa trong đó gia tăng lo ngại về bệnh béo phì và tác động của nó đối với sức khỏe [36]. Cải thiện chung của y tế và chăm sóc sức khỏe bằng cách giảm lượng đường và lượng calo tiêu thụ và tăng tiêu thụ với liều hàng ngày các vitamin và khoáng chất thiết yếu bằng đồ uống chức năng là nguồn tuyệt vòi của vitamin B, giúp đáp ứng nhu cầu của quá trình chuyến hóa năng lượng, và nguồn gốc của chất chống oxy hóa vitamin E và c giúp bảo vệ cơ thể của hoạt động cá nhân [50]. Một trong nhũng xu hướng là chế phấm sinh học cho sức khỏe đường ruột và tăng cưòng hệ thống miễn dịch, bộ nhó' và độ thoải mái tinh thần cũng đang tập trung vào đồ uống lên men [30]. Tác dụng phòng ngừa của trà xanh trên thận do tiểu đường đã được chứng minh [32], ảnh hưởng của kombucha lên men thức uống trà xanh bảo vệ chống lại các bệnh thoái hóa thận. Kombucha - sự cộng sinh của vi khuấn và nấm men đã được nuôi đế có được sản phấm đồ uống lành mạnh [45]. Kombucha đã có một thời nối tiếng tại Châu Âu và Hoa Kỳ, nhiều bài báo đã được viết về kombucha, được đăng tải trên các tạp chí quốc tế như “Taking the Fungal-Tea plunge, Newsweek, January 9, 1995”.
Cavusoglu K., Gluer p. (2010) đã phát hiện tác dụng bảo vệ của nấm trà kombucha trên nhiễm sắc thế gây ra bởi bức xạ gamma trong tế bào bạch huyết ngoại vi của con người trong ống nghiệm [19]. Dutta D., Gachhui R. (2006) đã phân lập vi khuấn Acetobacter nitrogen ni/igens sp.nov. cố định đạm từ trà kombucha [20]. Dutta D., Gachhui R. (2007) đã phân lập từ trà
22
kombucha vi khuẩn cố định đạm và cellulose là Gỉuconacetobacter kombucha
sp.nov. [21]. J Reiss, (1994) đã tìm hiểu ảnh hưởng của các loại đường khác
nhau lên quá trình trao đối chất của nấm trà [27]. Jayabalan R., Malini K., Sathishkumar M., Swaminathan K.,Yun S.-E. (2010) tìm hiểu đặc điểm sinh hóa của nấm trà [28]. K.H. Steinkraus, K.B. Shapiro, J.H. Hotchkiss, R.p. Mortlock,(1996) viết về hoạt động kháng sinh của trà nấm kombucha [34]. Nguyên Vu Tuan; Flanagan, Bemadine; Gidley, Michael J.; Dykes, Gary A. (2008) tìm hiểu đặc tính của màng BC bởi chủng Gluconacetobacter xylỉnus phân lập từ kombucha [48]. Petrushevska-Tozi L., Bauer-petrovska B. (2000) đã xác định được hàm lượng vitamin hòa tan và khoáng trong nước uống kombucha [42]. R.A. Ledford C.J. Greenwalt, and K.H. Steinkraus đã xác định và mô tả đặc điểm của các hoạt động chống vi khuẩn của kombucha trà lên men [43]. Velicanski, Aleksandra; Cvetkovic, Dragoljub; Markov, Sinisa; Tumbas, Vesna; Savatovic, Sladjana (2007) viết về hoạt động kháng khuẩn và chống oxy hóa của kombucha [48]. Yapar K., Cavusoglu K., Oruc E, Yalcin E. (2010) viết về tác dụng bảo vệ của nấm trà kombucha trên khả năng gây độc của phenol ở chuột bạch [52].
1.3.2. Ở Việt Nam
Ớ Việt Nam, những công trình nghiên cứu về kombucha còn rất khiêm tốn và chưa đầy đủ, hoàn chỉnh về khu hệ nấm men, vi khuấn lên men kombucha.
Theo Nguyễn Lân Dũng: hiện nay, lĩnh vực nghiên cứu về kombucha ở nước ta còn khá mói mẻ, chưa có một công trình nghiên cúu nào về kombucha cũng như hiệu quả chữa bệnh của loại trà này được công bố. Tác dụng chữa bệnh và độ độc hại của loại trà này cần phải được nghiên cứu, kiếm tra và giám định chắc chắn. Tóm lại, đây là một dạng cộng sinh giữa nấm men và vi khuẩn sinh acid acetic, có thế tự nhân giống bằng nước chè
đường, có lợi cho sức khỏe tương đưong như sữa chua. Nhiều công bố nói về tác dụng chữa bệnh hiểm nghèo nhưng không có cơ sở khoa học nào chứng thực như vậy. uống kombucha chỉ có lợi cho sức khỏe, nhất là cho đường tiêu hóa, không có tác hại gì.
Theo Vũ Văn Chuyên thì từ năm 1969, ở Bắc Thái (cũ) và Hà Nội, người ta đã phố biến cho nhau dùng nước thủy hoài sâm đế bồi dưỡng và phục hồi sức khỏe, chống lại bệnh tật. Từ năm 1994 đến nay, ở tỉnh Bình Định và một số nơi khác ở miền Nam đang lưu hành một loại nước uống có tính chất giải khát đặt tên là “Trà giấm” có tác dụng bồi bố, tăng cường sức khỏe, làm cho ăn ngon miệng, ngủ yên giấc và chữa được nhiều bệnh, nhất là bệnh huyết áp cao, chứng mất ngủ. Đinh Công Bảy, Tống thư ký Hội Dược liệu Thành phố Hồ Chí Minh, cho biết ông cũng nghe nói đến thủy sâm, tuy nhiên do chưa nghiên cứu nên chưa thế trả lời về công dụng thực sự của loại trà này. Hà Văn Hùng, Phó Viện trưởng Viện Y dược học dân tộc Thành phố Hồ Chí Minh cũng cho rằng cho đến nay Viện cũng chưa có công trình nào nghiên cứu về thủy sâm nên không biết rõ thành phần và công dụng của nó [53]. Lê Kim Phụng, nguyên giảng viên Trường Đại học Y dược Thành phố Hồ Chí Minh, người đã có một số bài viết về thủy sâm, cho biết: "Hiện nay ở nước ta đang xuất hiện một loại thuốc bố ở dạng long như trà mà mọi người gọi là trà "thủy sâm", thực ra đây chính là một loại thức uống có từ rất lâu được gọi tên là "The Remedy for Immortality", nghĩa là "Phương thuốc Trường sinh". Thủy sâm thực sự chỉ là một loại cái giấm (nấm men) phát triển dưới dạng một váng nhầy dày và dai, màu trắng. Loại giấm này sinh sôi nhanh trong môi trường nước chè (trà) pha đường. Thành phần trà kombucha có chứa men tiêu hóa, sinh tố và nhiều hợp chất hữu cơ. Phan Đức Bình, chuyên gia về dược liệu, Phó chủ tịch Hội Bảo vệ người tiêu dùng Thành phố Hồ Chí Minh cho biết, những quảng cáo kiểu trà kombucha có khả năng “ cải
24
lão hoàn đồng, tái tạo tóc, ngừa ung thư, trị bách bệnh...” đều không có những bàng chứng xác thực.
Sinh viên Lê Nguyễn Thị Hồng Ngọc và cs (2012), Đại học Mở TP. Hồ Chí Minh đã thực hiện đề tài “ Nghiên cứu hệ vi sinh vật của trà kombucha và
hiệu quả tác dụng trên một số chỉ tiêu sinh lý chuột”. Trong đề tài này nghiên
CÚ41 về hệ vi sinh vật trong kombucha bao gồm: vi khuấn acetic, vi khuấn lactic và nấm men, đồng thời khảo sát tác dụng của kombucha trên một số chỉ tiêu sinh lý của chuột như: cân nặng, tổng lượng hồng cầu, tổng lượng bạch cầu, sức khỏe của chuột thí nghiệm qua mô hình bơi kiệt sức. Ket luận: sản phẩm trà kombucha có tác dụng tăng cưòng sức khỏe, không gây ảnh hưởng xấu tới các chỉ tiêu sinh lý của chuột [54].
Sinh viên Tôn Nữ Liên Hưong thuộc khoa Khoa học Tự nhiên - Đại học Cần Thơ đã có bản báo cáo khoa học với tên đề tài “ Khảo sát ảnh hưởng
của thòi gian chế biến tới một so tính chất và hoạt tính sinh học của trà giấm kombucha”, tháng 3 năm 2013. Nội dung của bản báo cáo khoa học: giới
thiệu trà giấm kombucha, định hướng nghiên cứu thực nghiệm, tóm tắt các kết quả nghiên cún tính chất vật lý, hóa học của trà giấm kombucha được chế biến từ trà đóng gói hiệu lipton và từ trà đóng gói hiệu trà xanh, tóm tắt kết quả khảo sát hàm lượng của các hợp chất hữu cơ có hoạt tính trong trà giấm kombucha được chế biến từ trà đóng gói hiệu lipton và từ trà đóng gói hiệu trà xanh, tóm tắt về một số hoạt tính sinh học của trà giấm kombucha: tính kháng khuấn, kháng oxy hóa, độc tính trên tế bào ung thư, theo thời gian lưu mẫu, trên từng loại trà giấm [55].
CHƯƠNG 2
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu
2.1. Vật liệu và thiết bị nghiên cún
2.1.1. Đối tượng
Đối tượng nghiên cún là các chủng vi khuấn thuần khiết phân lập từ kombucha được lên men từ trà Thái Nguyên trong phòng thí nghiệm vi sinh, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2.
2.1.2. Hóa chất và thiết bị
2.1.2.1. Hóa chất
Nguồn cacbon: glucose (C6H]206 ), acid acetic... Nguồn nitơ: cao nấm men, pepton, (NH4)2S04 ... Nguồn muối khoáng: MgS04.7H20, KH2P04 ... Thuốc nhuộm: Fucshin, Lugol, ...
H2S04 , CaC03, thạch agar...
2.1.2.2. Thiết bị
• Tủ ấm, tủ sấy Binder (Đức) • Nồi hấp Tommy (nhật) • Box vô trùng (Haraeus)
• Máy lắc Orbital Shakergallenkump (Anh) • Máy li tâm Sorvall (Mỹ)
• Micropipet Jinson (Pháp) các loại từ 0.5pl - ĩOml • Máy đo pH (MP 200R - Thuỵ Sĩ)
• Cân (Precisa XT 320M - Thuỵ Sĩ) • Máy cất nước 2 lần (Hamilton - Anh) • Kính hiến vi quang học Carl Zeiss (Đức) • Buồng đếm Petroff - Housser
26
• Tủ lạnh Daewoo, tủ lạnh sâu, hộp lồng, ống nghiệm, bình tam giác, que trang, lamen, đèn cồn...và nhiều dụng cụ hoá sinh thông dụng khác.
2.1.3. Môi trường
* Môi trường phân lập giống (MT1)
Glucose : 20g MgS04.7H20 :2g
(NH4)2S04 : 3g CaC03: lOg
KH2P04 : 2g Agar: 20g
Pepton : 4g Nước máy : lOOOml
Acid acetic: 2% ( bổ sung sau khi khử trùng ) Rượu etylic : 2% ( bố sung sau khi khử trùng) * Môi trường nhân giống cơ bản (MT2)
Glucose : 20g MgS04.7H20 : 2g
(NH4)2S04: 3g KH2P04 : 2g
Pepton : 4g Nước máy : lOOOml
Acid acetic: 2% ( bô sung sau khi khử trùng ) Rượu etylic : 2% ( bổ sung sau khi khử trùng ) * Môi trường lên men kombucha (MT3)
Saccharose : lOOg Trà xanh Thái Nguyên: 20g Nước máy : 1 OOOml
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp vi sinh
2.2.1.1. Phương pháp phân lập vỉ khuân và quan sát hình thải
tê bào trên tiêu
bản nhuộm Gram
a. Phân lập vi khuẩn theo phương pháp Vinogradski
Đe có được chủng vi khuấn chúng tôi tiến hành phân lập từ nguồn nguyên liệu là kombucha. Trước hết cần thực hiện quá trình lên men kombucha từ trà Thái Nguyên thu được mẫu màng lên men giấm tự nhiên.
Cách làm: lấy dịch lên men kombucha lắc đều bằng máy vôntex trong 10 phút thu đuợc huyền phù vi sinh vật. Pha loãng dịch huyền phù ở các nồng độ khác nhau từ 10_1 đến 10~8. Dùng pipet hút 50pl mẫu ở các độ pha loãng 103 đến 10‘8 nhở lên mặt môi trường thạch vô trùng trong hộp petri, dùng que trang trang đều. Sau đó ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ thích hợp trong 2-3 ngày. Dựa vào sự khác nhau của hình thái khuấn lạc tiến hành tách một số khuấn lạc đặc trưng ra khỏi môi trường phân lập, cấy thuần sau đó chuyển sang thạch
nghiêng bảo quản trong tủ 4°c [7], [8], [10].
b. Quan sát hình thái tế bào trên tiêu bản nhuộm Gram
Nhuộm Gram là phưong pháp nhuộm sử dụng hai hay nhiều loại thuốc nhuộm trên một tiêu bản nhằm quan sát và định loại tế bào vi khuấn dựa trên khả năng hình thành trong tế bào hợp chất bền vững của protein đặc biệt với thuốc nhuộm kiềm và iốt.
Đe tiến hành phương pháp nhuộm Gram cần lấy mẫu từ các chủng đã qua sơ tuyến làm tiêu bản. Khi đó tùy vào màu của tiêu bản thu được giúp ta phân biệt được vi khuấn Gr' hay Gr+. Neu sau khi nhuộm kép tế bào bắt màu hồng thì đó là vi khuẩn Gr', bắt màu tím là vi khuấn Gr+. Bản chất của hiện tượng bắt màu khác nhau này là do chất nguyên sinh của tế bào vi khuấn Gr+ được cấu tạo từ một loại protein đặc biệt, chứa muối Nucleatmagie có khả năng tạo với tím Geltian và Lugol một loại phức chất bền, khó bị rửa trôi, khi quan sát tiêu bản trên kính hiển vi tế bào vi khuẩn Gr+ bắt màu tím geltian. Vi khuấn Gr không có khả năng giữ màu này nên dễ bị rửa trôi bởi cồn. Chỉ khi nhỏ Fucshin vi khuấn Gr mói bắt màu hồng của Fucshin [5], [8], [10], [11].
Sau đó soi tiêu bản dưới vật kính dầu và kính hiển vi quang học Olympus CH-2 (độ phóng đại 1000 lần).
28
2.2.1.2. Phương pháp xác định sổ lượng tế bào vỉ sinh vật bằng
phương pháp
đếm
a. Phương pháp đếm số lượng tế bào sống trên thạch đĩa
Lấy lml dịch huyền phù có chứa vi khuấn 24 giờ nuôi cấy, pha loãng theo phương pháp pha loãng giới hạn rồi dùng micropipet hút 0,1 ml pha loãng rồi trang đều trên môi trường thạch đĩa. Nuôi ở 30°c sau 3 ngày đếm số khuấn lạc (CFU) trong môi trường đĩa petri, từ đó xác định số lượng tế bào vi khuấn trong 1 ml dịch nuôi cấy ban đầu theo công thức.
. ÌOOO 1
Ì O O 1 0 ' 7
Trong đó: N- Tổng số CFU trong 1 ml dịch nuôi cấy ban đầu. A- Số CFU trung bình đếm được trên mỗi đĩa petri. 10~n - Độ pha loãng dịch nuôi cấy [6], [8], [11]. b. Phương pháp đếm số lượng tế bào bằng phòng đếm
Đây là phương pháp đếm trực tiếp số lượng tế bào vi sinh vật có trong mẫu phân tích. Pha loãng dịch huyền phú vsv đến 10", nhỏ một giọt dịch huyền phù ở độ pha loãng (n) vào giữa khung đếm và đậy lá kính, di chuyển nhẹ khung đếm cho dịch chiếm đầy khoang. Đem số lượng tế bào theo các ô theo đường chéo hoặc theo các góc ở trung tâm khung đếm. Thường đếm 4 ô lớn ở 4 góc và 1 ô lớn ở trung tâm của khung đếm để tính số lượng tế bào trung bình của ô lớn. Sau đó dùng công thức sau đế tính số tế bào trong lml lúc đầu:
N=A X 25 : V : n
Trong đó: N - số lượng tế bào trong lml dịch huyền phù lúc đầu
A - số lượng tế bào trung bình trong 1 ô lớn V — thê tích của 1 ô lón
2.2.1.3. Bảo quản chủng giống
a. Bảo quản trên thạch nghiêng
Các khuấn lạc sau khi phân lập và cấy chuyến sang môi trường giữ giống trong ống thạch nghiêng, nuôi 2 ngày ở tủ ấm 30°c. Sau đó giữ trong tủ lạnh 4°c dùng cho nghiên cứu tiếp theo, cấy chuyền giữ giống trên thạch nghiêng định kỳ mỗi tháng một lần [10], [12].
b. Bảo quản trong dung dịch glycerin 15%
Chủng vi khuấn được nuôi cấy trong môi trường dịch long ở 30°c sau 48 giờ đem li tâm dịch nuôi cấy trong 20 phút ở 3000 vòng/ phút, tách lấy phần sinh khối. Hoà đều sinh khối trong lml dung dịch glycerin 15% vô trùng giữ ở -80°c trong các ống eppendoí vô trùng. Bảo quản theo phương pháp này cho phép giữ giống trong vòng 1 đến 3 năm [9].
2.2.1.4. Phương pháp hoạt hóa giong
Giống từ ống nghiệm được bảo quản trong tủ lạnh, trước khi đem sử dụng phải hoạt hoá giống, nhân giống đảm bảo đủ số lượng tế bào vi sinh vật cho quá trình lên men. Phương pháp hoạt hoá giống sử dụng môi trường tiêu chuấn không có thạch agar, đem hấp thanh trùng ở 121°c trong 20 phút. Sau đó đem xử lý trong đèn tím 15 phút, cấy chuyền giống từ ống thạch nghiêng vào và nuôi lắc 135 vòng/phút trong 24 giờ [12], [13].
2.2.2. Phương pháp hóa sinh
2.2.2.1. Phát hiện hoạt tính catalase
Nhỏ một giọt H202 3% lên bề mặt khuấn lạc, nếu thấy hiện tượng sủi bọt khí thì chủng vi khuấn đó được coi là có hoạt tính catalase (catalase +). Ngược lại, chủng vi khuẩn đó không có hoạt tính catalase (catalase -) [2], [5],
[8].
2.2.2.2. Phát hiện khả năng oxy hoá rượu etylic thành acid acetic
30
Cao nấm men: lOg Rượu êtylic: 10%-15% (vol/vol)
Nước máy : lOOOml pH: 6,8-7.0