6. Đóng góp của đề tài
3.3.1.1.Khảo sát ảnh hưởng của (NH2)2S04
Nguồn nitơ cung cấp cho cơ thế vi sinh vật nguyên liệu đế hình thành các nhóm amin trong các phân tử aminoacid, nucleotit, các bazơ dị vòng và các hợp chất hóa học trong nguyên sinh chất giúp cho vi sinh vật sinh trưởng và phát triển. Nguồn nitơ dễ hấp thụ nhất đối với vi sinh vật là NH3 và NH4+. Do đó tôi quyết định chọn nguồn nitơ là (NH4)2S04 và thay đối nồng độ từ 1 đến 3 g/1. Kết quả thu được thể hiện qua biểu đồ sau:
Hình 3.10. Biếu đồ hiểu diễn ảnh hưởng của (NH4)2S04 đến hàm lượng acid tống số sinh ra của 2 chủng Acetobacter A2 và A15
Từ biểu đồ ta nhận thấy hàm lượng acid tạo thành từ 2 chủng
Acetobacter A2 và Acetobacter A]5 đạt cực đại khi hàm lượng (NH4)2S04 bố
sung ở mức 2 g/1. Hàm lượng (NH4)2S04 bố sung cao quá hoặc thấp quá đều ảnh hưởng đến hàm lượng acid tạo thành. Nguyên nhân này được giải thích như sau: mỗi loài vi sinh vật đều có khả năng hấp thụ nhất định các chất dinh dưỡng khác nhau là khác nhau. (NH4)2SƠ4 cung cấp nguồn nitơ cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của tế bào vi khuẩn Acetobacter . Khi hàm lượng
<0 c 33,000 <5 1.5 2 2.5 3 Hàm lượng
49
(NH4)2S04 bổ sung quá cao vi khuẩn sẽ không thể hấp thụ hết, luợng (NH4)2S04 dư trong môi trường sẽ ức chế sự phát triển của tế bào vi khuấn cũng như đối với nấm men cùng sống cộng sinh trong kombucha. Neu hàm lượng (NH4)2S04 bố sung quá thấp sẽ không đủ cung cấp cho nhu cầu của vi khuấn, do vậy lượng acid tạo ra thấp. Mặt khác nitơ còn có mặt trong thành phần cấu tạo của nhiều hợp chất quan trọng như: acid nucleic, photphoslipid, một số coenzyme quan trọng như ATP, ADP, NADP, FAD và một số vitamin tham gia vào quá trình oxy hóa ethanol thành acid acetic.
Nhu vậy, hàm lượng (NH4)2S04 thích hợp bô sung cho quá trình lên men kombucha là 2 g/l.
3.3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của MgSỠ4.7H20
Chúng ta cần phải cung cấp một lưọng magie khá cao cho vi sinh vật. Magie mang tính chất của một cofactor, chúng tham gia vào nhiều phản ứng enzyme có liên quan đến quá trình phosphoryl hóa. Ngoài ra magie giữ vai trò quan trọng trong việc làm liên kết các tiểu phần ribosome với nhau [6]. Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của MgS04. 7H20 đến quá trình lên men kombucha ở các nồng độ khác nhau, kết quả được thể hiện qua biểu đồ sau:
□ Acetobacte r A2 0.5 1 1.5 2 2.5 Hàm lượng MgS04.7H20
Hình 3.11. Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của MgS04. 7H20 đến hàm lượng acid tống số sinh ra của 2 chủng Acetobacter Ả2 và A 75
Qua biểu đồ ta thấy hàm lượng MgS04. 7H20 bố sung cho quá trình lên men ảnh hưởng tới hàm lưọng acid tống số sinh ra. Mg là một nhân
tố tham gia tạo thành enzyme có liên quan đến quá trình phosphoryl hóa. Hàm lượng MgS04.7H20 quá thấp sẽ không đủ cung cấp cho hoạt động của tế bào vi khuấn, nếu hàm lượng quá cao sẽ ức chế quá trình tạo ra acid.
Như vậy, hàm lượng MgS04. 7H20 cần bô sung cho quả trình lên men kombucha là ĩ,5 g/l.
33.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của KH2PO4
Phospho(P) và các hợp chất chứa phospho cũng như nồng độ của chúng trong môi trường có ảnh hưởng rất lớn đến quá trình trao đối chất của tế bào vi sinh vật. Khi thay đối nồng độ các hợp chất phospho trong môi trường sẽ dẫn đến thay đối hàng loạt các quá trình tống họp các chất họp phần của tế bào có chứa phospho, tế bào chất và nhân. Ngoài ra, phospho trong môi trường có tác dụng điều chỉnh hoạt tính enzyme đồng hóa thức ăn cacbon.
Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của KH2PO4 đến quá trình lên men kombucha ở các nồng độ khác nhau, kết quả thu được như sau:
□
Acetobact
er A2
0.5 1 1.5 2 2.5
Hàm lượng KH2P04 (g/i)
Hình 3.12. Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của KH2PO4 đến hàm lượng acid tons số sinh ra của2 chủng Acetobacter Ả2và A/5
KH2PO4 1,0 (g/1) KH2P04 1,5 (g/1)
Hình 3.13. Anh kombucha lên men từ chủng
Chủng Ngày M+m (g/1) õ (%) Cv(% ) A2 0 0,000+0,000 0,000 0,000 1 4,310+0,006 0,010 2,320 2 9,380+0,023 0,040 4,264 3 15,610+0,010 0,017 1,089 4 23,250+0,035 0,061 2,624 5 29,810+0,004 0,007 0,235 6 31,320+0,017 0,030 0,958 7 32,450+0,053 0,092 2,835 8 32,890+0,099 0,171 5,199 9 33,150+0,035 0,061 1,840 A,5 0 0,000+0,000 0,000 0,000 1 5,120+0,017 0,030 5,859 2 9,950+0,035 0,061 6,131 3 16,720+0,023 0,040 2,392 4 22,190+0,039 0,069 3,110 5 28,920+0,034 0,059 2,040 6 31,290+0,027 0,046 1,470 7 32,820+0,012 0,020 0,609 8 33,010+0,053 0,092 2,787 9 33,190+0,021 0,036 1,085 51
Qua biểu đồ trên cho thấy, ở hàm lượng 1,0 g/1 môi trường cho hiệu suất lên men cao nhất.
Có nhiều nguyên nhân dẫn đến ảnh hưởng của hàm lượng acid sinh ra nhưng chủ yếu là do phospho và kali có nhiều trong thành phần cấu tạo quan trọng của tế bào vi khuấn như: acid nucleic, protein, phospholipid và nhiều coenzyme quan trọng như ADP, ATP, NADP,... tham gia vào quá trình oxy hóa rượu thành acid acetic đến cơ2 và H2Ơ. Khi hàm lượng KH2P04 từ 2,5 g/1 trở lên sẽ dẫn tới dư thừa nó làm thay đối đặc tính lý hóa của môi trường, ức chế quá trình sinh trưởng và phát triến của vi khuấn dẫn tới ảnh hưởng đến hàm lượng acid acetic sinh ra. Ngược lại nếu lượng phospho kali quá thấp (dưới 0,5 g/1) sẽ ảnh hưởng tới việc cấu thành coezyme xúc tác cho phản ứng trong quá trình sinh trưởng của vi khuẩn. Hàm lượng KH2PƠ4 bổ sung cho quá trình lên men kombucha là 1,5 g/1.
Như vậy, hàm lượng (NH4)2S04, MgS04.7H20, KH2P04 bô sung cho quá trình lên men kombucha lần lượt là 2; 1,5; 1,5 (g/ỉ). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.3.2. Khảo sát ánh hưởng của điều kiện môi trường tới quá trình lên men kombucha
3.3.2. ỉ. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên men
Khi nuôi cấy Acetobacter A2 và Acetobacter Aì5 trong MT3 đã được thanh trùng ở 110°c trong vòng 20 phút, trong điều kiện nuôi cấy tĩnh ở 30°c, nhận thấy:
Trong ngày đầu, số lượng tế bào trong dịch nuôi cấy tăng nhưng ở mức độ chậm. Vì ở giai đoạn này vi khuấn làm quen với môi trường, tích lũy chất dinh dưỡng và năng lượng cho các giai đoạn tiếp theo. Đồng thời với quá trình tăng trưởng tế bào thì lượng acid cũng bắt đầu hình thành, pH môi trường giảm nhẹ.
52
Từ ngày thứ 2 đến ngày thứ 7 lưọng acid tăng nhanh, giai đoạn này các tế bào sinh trưởng mạnh và biến đối êtylic thành acid acetic. Từ ngày thứ 7 trở đi lượng acid vẫn tiếp tục tăng nhưng với tốc độ chậm. Ket quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên men được thế hiện qua bảng sau:
Bảng 3.5. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên men đến hàm lượng acỉd tống số sinh ra của 2 chủng Acetobacter A2 và AI5
A2 2 4 28,920+0,010 0,017 0,588 6 30,040+0,035 0,061 2,031 8 32,110+0,004 0,007 0,218 10 32,340+0,017 0,030 0,928 12 33,060+0,053 0,092 2,783 Ai5 2 28,710+0,099 0,171 5,956 4 29,570+0,035 0,061 2,063 6 31,250+0,021 0,036 1,152 8 32,360+0,017 0,030 0,927 10 32,980+0,035 0,061 1,850 12 33,110+0,023 0,040 1,209
Từ kết quả dẫn ra ở 3ẩng 3.6, nhận thấy: Tỷ lệ giống bố sung từ 2
Chủng pH M±m (g/1) ô (%) c v ( % ) A 2 3 30,920+0,053 0,092 2,975 3,5 31,800+0,099 0,171 5,377 4 32,890+0,035 0,061 1,855 4,5 32,000+0,000 0,000 0,000 5 31,850+0,017 0,030 0,942 A,5 3 31,230+0,035 0,061 1,953 3,5 31,910+0,023 0,040 1,254 4 32,960+0,039 0,069 2,093 4,5 32,750+0,034 0,059 1,802 5 31,300+0,027 0,046 1,470 Chủng Nhiệt độ(°C) M+m (g/1) ố (%) cv(%) A2 15 13,210+0,035 0,061 3,544 20 27,920+0,004 0,007 0,251 25 32,390+0,017 0,030 0,926 30 33,010+0,053 0,092 2,787 35 31,970+0,099 0,171 5,349 40 22,100+0,035 0,061 5,041 A|5 15 16,450+0,000 0,000 0,000 20 28,100+0,017 0,030 1,068 25 30,570+0,035 0,061 1,873 30 32,990+0,023 0,040 1,212 35 30,510+0,039 0,069 2,186
5 ngày 7 ngày 9 ngày
Hình 3.14. Anh kombucha lên men từ chủng Acetobacter Ả2 với thòi gian lên men 5,7 và 9 ngày
Thời gian lên men càng lâu thì lượng acid sinh ra càng tăng, độ pH càng ngày càng giảm làm cho sản phấm trở nên chua hon. Đe thu được sản phấm kombucha thơm, ngon, có vị chua dịu mát chúng ta nên thu sản phấm ở ngày lên men thứ 7 của quá trình lên men.
33.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng giống bô sung ban đầu
Hàm lượng giống là một trong những yếu tố quyết định đến quá trình lên men, cần có tỷ lệ giống phù họp vói quá trình lên men nhằm đạt hiệu suất lên men cao và cho ra chất lượng sản phẩm kombucha thơm, ngon. Hàm lượng giống bổ sung trước khi lên men là rất quan trọng. Neu bổ sung không đủ giống thì quá trình lên men diễn ra chậm, hơn nữa dịch lên men sẽ dễ nhiễm tạp. Ngược lại, nếu bố sung nhiều giống quá thì hàm lượng dinh dường trong dịch lên men có thế không đáp ứng đủ cho vi khuấn sinh trưởng và tăng sinh khối, xét về mặt kinh tế sẽ làm tăng giá thành sản phấm. Chúng tôi tiến hành cấy 2 chủng vào môi trường dịch lên men với tỷ lệ giống ban đầu là: 2, 4, 6, 8, 10,12%v. Sau 7 ngày lên men chúng tôi tiến hành đo hàm lượng acid sinh ra, kết quả thu được như sau:
Bảng 3.6. Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng giống đến hàm lượng acid
6% là không phù hợp. Ớ tỷ lệ giống này thời gian lên men diễn ra dài hơn, tốc độ lên men diễn ra chậm, dịch lên men dễ bị nhiễm tạp. Tỷ lệ giống bô sung là 8% quá trình lên men tương đối tốt, tuy nhiên chưa thực sự tạo ra được mùi vị đặc trung của kombucha. Ớ tỷ lệ giống bố sung là 10% và 12%, nhận thấy quá trình lên men diễn ra nhanh, sản phấm tạo ra có vị thơm ngon đặc trưng. Nhận thấy tỷ lệ giống càng tăng thì thời gian lên men càng được rút ngắn (trong giới hạn nhất định tuỳ thuộc vào hàm lượng dinh dường có trong dịch lên men). Tuy nhiên, tỷ lệ giống càng nhiều dẫn đến quá trình lên men diễn ra càng nhanh thì lượng acid tạo ra càng nhiều và làm cho sản phẩm nhanh chua sẽ ảnh hưởng đến chất lượng của sản phẩm.
Như vậy, để quá trình lên men kombucha được tốt, chủng tôi quyết định chọn tỷ lệ giong bô sung ban đầu là 10%.
3.3.2.3. Khảo sát ảnh hưởĩĩg của độ pH ban đầu
Giá trị pH được đo bằng nồng độ các ion H+ và OH có trong môi trường, độ pH ban đầu của môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng trực tiếp hoặc gián tiếp đến tính chất sinh lý của tế bào nên ảnh hưởng đến khả năng lên men kombucha. Tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của độ pH đối với quá trình lên men kombucha trên môi trường dịch lên men có độ pH khác nhau: 3; 3,5; 4; 4,5; 5. Sau thời gian 7 ngày ở 30°c kết quả thu được như sau:
Bảng 3.7. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hàm lượng acid tống số sinh ra của 2 chủng Acetobacter Ả2 và AJ5
pH: 4 pH: 5
Hình 3.15. Anh kombucha lên men từ chủng Acetobacter A]5 với giá trị pH ban đầu là 4 và 5
Từ kết quả ở bảng 3.7 cho thấy, pH từ 4 - 4,5 cho ra lượng acid cao nhất. Với pH: 5, lượng acid sinh ra ít hơn, cùng với đó là nguy cơ bị nhiễm nấm mốc và các vi sinh vật khác làm sản phẩm dễ bị hỏng. Còn mức pH từ 3 -3,5 lượng acid sinh ra thấp hơn vì trong thời gian đầu vi khuấn Acetobacter khó chịu đựng được mà phải làm quen dần với môi trường.
Như vậy, với lên men kombucha, pH ban đầu thích họp là 4 - 4,5. 33.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ cũng là một yếu tố quan trọng quyết định đến quá trình lên men kombucha. Nhiệt độ thấp quá hay cao quá đều không có lợi cho quá trình lên men cũng như chất lượng sản phấm. Nhiệt độ thấp làm cho vi khuấn sinh trưởng chậm, thời gian lên men kéo dài. Nhiệt độ cao làm tăng quá trình hô hấp trong tế bào vi khuấn ảnh hưởng tới quá trình lên men. Đe xác định được nhiệt độ thích hợp nhất cho lên men, chúng tôi tiến hành nuôi 2 chủng vi khuấn ở các ngưỡng nhiệt độ khác nhau sau 7 ngày lên men, xác định hàm lượng acid tạo thành. Ket quả thí nghiệm được dẫn ra ở bảng sau:
Bảng 3.8. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng acid tổng số sinh ra của 2 chủng Acetobacter Ả2 và Ảì5
Nhiệt độ 20°c Nhiệt độ 30°c
Hình 3.16. Anh kombucha lên men từ chủng Acetobacter Ả2 ở nhiệt độ 2(fC và 30°c
Từ kết quả bảng 3.8 cho thấy vi khuẩn Acetobacter là chủng vi khuẩn ưa ấm có thể sinh trưởng trong khoảng nhiệt độ từ 25 - 35°c. Nhiệt độ tối ưu cho quá trình lên men là 30°c. Nhiệt độ 15 - 20°c, tốc độ quá trình lên men diễn ra chậm, thời gian lên men kéo dài. Ớ nhiệt độ trên 35°c ức chế quá trình sinh trưởng và lên men vì ở nhiệt độ cao sẽ làm bay hơi acid acetic tạo thành trong môi trường làm tăng pH dịch nuôi cấy ảnh hưởng tới quá trình lên men. Như vậy nhiệt độ thích họp cho quá trình lên men kombucha là 30°c. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Như vậy: hàm lượng giống, pH ban đầu, nhiệt độ thích hợp nhất cho quá trình lên men kombucha lần lượt là 10%, 4 - 4,5 và 30°c.
3.4. Xây dựng quy trình lên men kombucha
3.4.1. Khảo sát về thiết bị lên men
Khi lên men kombucha, quá trình sinh trưởng của vi khuấn sẽ tạo ra ngoài môi trường rất nhiều chất trao đối khác nhau. Đặc biệt, quá trình sinh trưởng của Acetobacter sẽ sinh ra acid acetic (sau 7 ngày nuôi cấy đo được pH: 2,5) làm môi trường bị chua. Vì vậy, thiết bị lên men phải có đặc tính bền với acid. Bên cạnh đó, thiết bị lên men cũng phải chịu được nhiệt độ cao khi thanh trùng môi trường lên men (121°C). Chúng tôi tiến hành lên men trong các bình chịu nhiệt làm bằng nhựa, inox, thủy tinh.
Đặc điểm Vật liệu
Inox Thủy tinh Nhựa
Bị ăn mòn bới acid acetic ịpH = 3)
Inox có thê bị ăn
mòn Không Không
Có thê quan sát quả trình lên men Không quan sát được Quan sát dễ dàng Quan sát dễ dàng Giá thành của bình lên men kích thước
10x15x4
Cao (inox thường có giá > 30.000 đồng,
inox chịu acid có giá >
70.000 đồng)
Cao (> 50.000 đồng)
Thấp (> 6.000 đồng)
Rủi ro trong quá trình sử dụng
Có thể bị biến dạng Dễ vỡ Có thê bị biên dạng
58
Hình 3.17. Lên men kombucha trong cốc inox thường 15Omỉ, sau quá trình lên men phần đáy cốc thường bị ăn mòn bởi acid acetic
Hình 3.18. Lên men kombucha trong cốc thủy tinh 250ml
Hình 3.19. Lên men kombucha trong hộp nhựa 500ml
Từ kết quả quan sát các bình lên men sau khi quá trình lên men trên kết thúc, kết họp với quá trình tham khảo giá của các vật liệu trên thị truờng. Chúng tôi tiến hành so sánh một số đặc điếm khác nhau khi lên men kombucha trong các dụng cụ làm bằng inox, thủy tinh, nhựa ở bảng 3.9.
59
Bảng 3.9. Một số đặc điếm so sánh khi lên men kombucha ở các dụng cụơ • • • o •
______________làm băng các vật liệu inox , thủy tinh, nhựa _________________
Từ kêt quả dẫn ra ở bảng 3.9, có thể thây: bình lên men làm bằng vật liệu inox chịu acid có 2 nhuợc điềm lớn nhất là không quan sát được quá trình lên men và giá thành cao, do đó không nên dùng đế lên men kombucha. Bình làm bằng vật liệu thủy tinh có thế dùng lên men kombucha nhưng dễ vỡ, giá thành lại cao. Bình lên men làm bằng vật liệu nhựa chịu nhiệt không bị ăn mòn bởi acid acetic, có thế quan sát được diễn biến của quá trình lên men, sử dụng một thời gian dài (ít nhất 1 tuần lên men 1 lần, liên tục trong 6 tháng) khi đó nhựa mới bị cứng và vỡ, tuy nhiên giá thành của nhựa chịu nhiệt lại rất rẻ.
Như vậy, sử dụng bình làm bằng nhựa là tốt nhất cho quá trình lên men kombucha quy mô phòng thí nghiệm
3.4.2. Quy trình lên men kombucha quy mô phòng thí nghiệm
Trong quá trình lên men kombucha có thê sử dụng các nguôn nguyên liệu khác nhau, tuy nhiên tôi quyết định sử dụng nguồn nguyên liệu trà xanh đế lên men với mong muốn sản phấm thu được vừa có mùi vị đặc trưng của (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
kombucha, vừa có hương vị của trà xanh. Trà xanh là sản phấm được sử dụng phố biến tại các gia đình với nhiều nguồn gốc xuất xứ khác nhau, trong các